携带特异miRNA靶序列的重组寨卡病毒及其应用的制作方法

文档序号：20278552发布日期：2020-04-07 14:52阅读：373来源：国知局

本发明涉及重组病毒领域，具体地，涉及一种携带特异mirna靶序列的重组寨卡病毒及其应用。

背景技术：

寨卡病毒(zikavirus，zikv)是单股正链rna病毒，病毒颗粒直径约50nm，与日本脑炎病毒、登革病毒、西尼罗病毒等同属黄病毒科黄病毒属。寨卡病毒基因组长约为10.7kb，包括5’和3’非编码区以及一个单一开放读码框。该开放读码框编码3种结构蛋白(c、pr/m、e)和7种非结构蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5)。寨卡病毒病是由寨卡病毒引起的一种蚊媒病毒病，主要通过伊蚊进行传播。2015年以后，拉丁美洲寨卡病毒病暴发，同时伴随大量新生儿出现小头症。2016年2月1日，世界卫生组织(who)将其列为全球关注的突发公共卫生事件。目前，国内外尚无有效的疫苗和药物可以预防和治疗寨卡病毒病。

减毒活疫苗是一种重要的疫苗类型，它可以全面激活体液和细胞免疫应答反应，使机体获得更广泛持久的免疫保护。近年来，microrna(mirna)介导的靶向减毒策略在病毒疫苗研究领域中取得了突破性进展，其主要机制是将组织细胞内特异表达的mirna的靶序列插入到病毒基因组中，利用组织内特异的mirna靶向降解病毒基因组，抑制病毒在该组织中的复制，进而降低或消除病毒在特定组织的增殖和致病效应。这一策略保留病毒免疫原性的同时又可降低病毒致病性，为研制新型减毒活疫苗提供了重要手段。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种特异降低寨卡病毒组织嗜性的方法及其用途。

寨卡病毒具有明显的神经嗜性和神经毒力，特别是能够特异感染神经前体细胞，导致胚胎脑中神经干细胞的增殖与分化异常，造成神经元大量死亡，引起小头症。因此，如果将脑组织特异表达的mirna靶序列插入寨卡病毒基因组，将能够抑制寨卡病毒在脑组织中的复制，显著降低寨卡病毒神经毒力和导致小头症的发生风险，并可作为下一代更为安全的寨卡减毒活疫苗。

因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种dna分子，该dna分子含有串联连接的5’非编码区序列、结构蛋白编码序列、非结构蛋白编码序列、和插入有mirna靶序列的编码序列的3’非编码区序列，其中，所述5’非编码区序列、结构蛋白编码序列、非结构蛋白编码序列和3’非编码区序列来源于寨卡病毒；所述mirna靶序列的编码序列能够抑制寨卡病毒的增殖。

第二方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒含有如上所述的dna分子。

第三方面，本发明提供了一种重组寨卡病毒，该重组寨卡病毒的基因组rna对应的cdna序列与如上所述的dna分子的序列相同。

第四方面，本发明提供了一种构建重组寨卡病毒的方法，该方法包括：在寨卡病毒的基因组rna的3’非编码区插入mirna靶序列，使得重组寨卡病毒在神经系统中的复制能力低于插入mirna靶序列前的寨卡病毒。

第五方面，本发明提供了如上所述的dna分子、重组质粒和重组寨卡病毒中的至少一种在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的用途。

进一步地，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗的活性成分为上述重组寨卡病毒。本发明还进一步提供了预防寨卡病毒感染或预防寨卡病毒感染引起的小头症的方法，该方法包括为受试者接种上述重组寨卡病毒或疫苗。所述受试者可以为哺乳动物，如灵长类动物或啮齿类动物，例如，人和/或鼠。

基于本发明提供的dna分子，本发明构建的重组寨卡病毒具有如下优点：(1)在正常细胞有效复制，在神经细胞和组织中复制能力明显降低，具有明确的减毒特征；(2)mirna靶序列整合到寨卡病毒的基因组序列中，减毒特征明确，遗传稳定性好，回复为野生型病毒的可能性极低；(3)只在细胞质中复制(即rna病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；(4)能诱导产生针对野生型寨卡病毒的免疫应答；(5)能够在动物模型中保护动物免受致死剂量的野生型寨卡病毒的攻击。综上所述，本发明所提供的重组寨卡病毒可作为寨卡病毒疫苗，对于预防寨卡病毒感染具有良好的应用前景。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为构建携带有mirna序列的重组寨卡病毒模式图；

图2为实施例2中间接免疫荧光的结果；

图3为实施例3中空斑试验的结果；

图4为实施例4中重组病毒的在不同细胞内的增殖特征；

图5为实施例5中重组病毒在乳鼠颅内复制情况；

图6为实施例6中重组病毒在成鼠脏器的分布情况；

图7为实施例7中重组病毒的神经毒力特征；

图8为实施例8中重组病毒的免疫原性。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供的dna分子含有串联连接的5’非编码区序列、结构蛋白编码序列、非结构蛋白编码序列、和插入有mirna靶序列的编码序列(mirna编码序列)的3’非编码区序列，其中，所述5’非编码区序列、结构蛋白编码序列、非结构蛋白编码序列和3’非编码区序列来源于寨卡病毒；所述mirna靶序列的编码序列能够抑制寨卡病毒的增殖(也即抑制寨卡病毒基因组的复制，特别是5’非编码区序列、结构蛋白编码序列、非结构蛋白编码序列和3’非编码区序列来源的寨卡病毒的增殖或复制)。所述mirna靶序列的编码序列尤其能够抑制寨卡病毒在神经系统中的增殖或复制，具有神经系统特异性。所述神经系统可以为脑，如哺乳动物(灵长类动物或啮齿类动物，例如，人和/或鼠)的脑。

其中，本发明中使用的“来源于”意指根据病毒的基因序列(rna)构建dna分子，并不限于从病毒基因组中提取获得基因序列，例如，来源于寨卡病毒的序列是指与寨卡病毒的基因序列具有90％以上(优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或上述数值之间的任意值)的同一性的序列；“串联连接”是指将多核苷酸(或多肽)元件以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能，被连接的多核苷酸(或多肽)序列是连续的。

根据本发明，所述mirna靶序列的编码序列为能够抑制寨卡病毒在神经系统(如胚胎脑组织)中的复制的序列，可以为多种mirna靶序列的编码序列的串联，优选情况下，所述mirna靶序列的编码序列为seqidno：1-6中的任意一种。

tcatacagctagataaccaaaga(seqidno：1)

atcaaggtccgctgtgaacacg(seqidno：2)

tcacaggttaaagggtctcaggga(seqidno：3)

tcatacagctagataaccaaagacacgtcatacagctagataaccaaagacacgtcatacagctagataa

ccaaaga(seqidno：4)

atcaaggtccgctgtgaacacgcacgatcaaggtccgctgtgaacacgcacgatcaaggtccgctgtgaa

cacg(seqidno：5)

tcacaggttaaagggtctcagggacacgtcacaggttaaagggtctcagggacacgtcacaggttaaagg

gtctcaggga(seqidno：6)

根据本发明，只要将所述mirna靶序列的编码序列插入3’非编码区序列即可实现本发明的目的，也即，所述mirna靶序列的编码序列的插入位置可以为3’非编码区序列的前端、末端或中间，优选情况下，所述mirna靶序列的编码序列的插入位点为3’非编码区序列的前端(5’端)。

根据本发明一种优选的实施方式，所述dna分子的序列与第10379与10380位碱基之间插入有所述mirna靶序列的编码序列的ku955593序列具有至少90％以上(优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或上述数值之间的任意值)的同一性。

根据本发明的最优选实施方式，所述dna分子的序列与seqidno：13所示的序列(第10379与10380位碱基之间插入有seqidno：5的ku955593序列)具有至少90％以上(优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或上述数值之间的任意值)的同一性。

agttgttgatctgtgtgaatcagactgcgacagttcgagtttgaagcgaaagctagcaacagtatcaacaggttttattttggatttggaaacgagagtttctggtcatgaaaaacccaaagaagaaatccggaggattccggattgtcaatatgctaaaacgcggagtagcccgtgtgagcccctttgggggcttgaagaggctgccagccggacttctgctgggtcatgggcccatcaggatggtcttggcgattctagcctttttgagattcacggcaatcaagccatcactgggtctcatcaatagatggggttcagtggggaaaaaagaggctatggaaataataaagaagtttaagaaagatctggctgccatgctgagaataatcaatgctaggaaggagaagaagagacgaggcacagatactagtgtcggaattgttggcctcctgctgaccacagccatggcagtggaggtcactagacgtgggaatgcatactatatgtacttggacagaagcgatgctggggaggccatatcttttccaaccacaatggggatgaataagtgttatatacagatcatggatcttggacacatgtgtgatgccaccatgagctatgaatgccctatgctggatgagggggtagaaccagatgacgtcgattgttggtgcaacacgacgtcaacttgggttgtgtacggaacctgccaccacaaaaaaggtgaagcacggagatctagaagagctgtgacgctcccctcccattccactaggaagctgcaaacgcggtcgcagacctggttggaatcaagagaatacacaaagcacctgattagagtcgaaaattggatattcaggaaccctggcttcgcgttagcagcagctgccatcgcttggcttttgggaagctcaacgagccaaaaagtcatatacttggtcatgatactgctgattgccccggcatacagcatcaggtgcataggagtcagcaatagggactttgtggaaggtatgtcaggtgggacttgggttgatgttgtcttggaacatggaggttgtgttaccgtaatggcacaggacaaaccgactgtcgacatagagctggttacaacaacagtcagcaacatggcggaggtaagatcctactgctatgaggcatcaatatcggacatggcttcggacagccgctgcccaacacaaggtgaagcctaccttgacaagcaatcagacactcaatatgtctgcaaaagaacgttagtggacagaggctggggaaatggatgtggactttttggcaaagggagcctggtgacatgcgctaagtttgcttgctctaagaaaatgaccgggaagagcatccagccagagaatctggagtaccggataatgctgtcagttcatggctcccagcacagtgggatgatcgttaatgatacaggacatgaaactgatgagaatagagcgaaggttgagataacgcccaattcaccaagagccgaagccaccctggggggttttggaagcctaggacttgattgtgaaccgaggacaggccttgacttttcagatttgtattacttgactatgaataacaagcactggttggttcacaaggagtggttccacgacattccattaccttggcatgctggggcagacaccggaactccacactggaacaacaaagaagcactggtagagttcaaggacgcacatgccaaaaggcagactgtcgtggttctagggagtcaagaaggagcagttcacacggcccttgctggagctctggaggctgagatggatggtgcaaagggaaggctgtcctctggccacttgaaatgtcgcctgaaaatggataaacttagattgaagggcgtgtcatactccttgtgtaccgcagcgttcacattcactaagatcccggctgaaacactgcacgggacagtcacagtggaggtacagtacgcagggacagatggaccttgcaaggttccagctcagatggcggtggacatgcaaactctgaccccagttgggaggttgataaccgctaaccctgtaatcactgaaagcactgagaactccaagatgatgctggaactggatccaccatttggggactcttacattgtcataggagtcggggaaaagaagatcacccaccactggcacaggagtggcagcaccattggaaaagcatttgaagccactgtgagaggtgccaagagaatggcagtcttgggagacacagcctgggactttggatcagttgggggtgctctcaactcactgggcaagggcatccatcaaatttttggagcagctttcaaatcattgtttggaggaatgtcctggttctcacaaattctcattggaacgttgctggtgtggttgggtctgaatacaaagaatggatctatttcccttatgtgcttggccttagggggagtgttgatcttcttatccacagccgtctctgctgatgtggggtgctcggtggacttctcaaagaaggaaacgagatgcggtacaggggtgttcgtctataacgacgttgaagcttggagggacaggtacaagtaccatcctgactcccctcgtagattggcagcagcagtcaagcaagcctgggaagatgggatctgtgggatctcctctgtttcaagaatggaaaacatcatgtggagatcagtagaaggggagctcaacgcaatcctggaagagaatggagttcaactgacggtcgttgtgggatctgtaaaaaaccccatgtggagaggtccacagagattgcccgtgcctgtgaacgagctgccccatggctggaaggcttgggggaaatcgtacttcgtcagggcagcaaagacaaataacagctttgtcgtggatggtgacacactgaaggaatgcccactcaaacatagagcatggaacagctttcttgtggaggatcatgggttcggggtatttcacactagtgtctggctcaaggttagagaagattattcattagagtgtgatccagccgtcattggaacagccgctaagggaaaggaggctgtgcacagtgatctaggctactggattgagagtgagaagaacgacacatggaggctgaagagggcccacctgatcgagatgaaaacatgtgaatggccaaagtcccacacattgtggacagatggaatagaagaaagtgatctgatcatacccaagtctttagctgggccactcagccatcacaacaccagagagggctacaggacccaaatgaaagggccatggcatagtgaagagcttgaaattcggtttgaggaatgcccaggcactaaggtccacgtggaggaaacatgtggaacaagaggaccatctctgagatcaaccactgcaagcggaagggtgatcgaggaatggtgctgcagggagtgcacaatgcccccactgtcgttccgggctaaagatggttgttggtatggaatggagataaggcccaggaaagaaccagaaagtaacttagtaaggtcaatggtgactgcaggatcaactgatcacatggatcacttctcccttggagtgcttgtgattctgctcatggtacaggaagggctaaagaagagaatgaccacaaagatcatcataagcacatcaatggcagtgctggtagctatgatcctgggaggattttcaatgagtgacctggctaagcttgcaattttgatgggtgccaccttcgcggaaatgaacactggaggagatgttgctcatctggcgctgatagcggcattcaaagtcagacctgcgttgctggtatctttcattttcagagctaattggacaccccgtgagagcatgctgctggccttggcctcgtgtcttctgcaaactgcgatctccgccttggaaggcgacctgatggttcccatcaatggttttgctttggcctggttggcaatacgagcgatggttgttccacgcactgacaacatcaccttggcaatcctggctgctctgacaccactggcccggggcacactgcttgtggcgtggagagcaggccttgctacttgcggggggttcatgctcctttctctgaaggggaaaggcagtgtgaagaagaacttaccatttgtcatggccctgggactaaccgctgtgaggctggtcgaccccatcaacgtggtgggactgctgttgctcacaaggagtgggaagcggagctggccccctagtgaagtactcacagctgttggcctgatatgcgcattggctggagggttcgccaaggcggatatagagatggctgggcccatggccgcggtcggtctgctaattgtcagttacgtggtctcaggaaagagtgtggacatgtacattgaaagagcaggtgacatcacatgggaaaaagatgcggaagtcactggaaacagtccccggctcgatgtggcactagatgagagtggtgatttctccctagtggaggatgatggtccccccatgagagagatcatactcaaagtggtcctgatggccatctgtggcatgaacccaatagccataccctttgcagctggagcgtggtacgtgtatgtgaagactggaaaaaggagtggtgctctatgggatgtgcctgctcccaaggaagtaaaaaagggggagaccacagatggagtgtacagagtaatgactcgtagactgctaggttcaacacaagttggagtgggagtcatgcaagagggggtcttccacactatgtggcacgtcacaaaaggatccgcgctgagaagcggtgaagggagacttgatccatactggggagatgtcaagcaggatctggtgtcatactgtggtccatggaagctagatgccgcctgggacgggcacagcgaggtgcagctcttggccgtgccccccggagagagagcgaggaacatccagactctgcccggaatatttaagacaaaggatggggacattggagcagttgcgctggac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本发明提供的重组质粒含有如上所述的dna分子。所述重组质粒既可以为重组克隆载体，也可为重组表达载体。根据本发明的一种实施方式，所述重组质粒可以为质粒的多克隆位点(如ecori-hf和clai)间插入有所述dna分子的重组质粒。所述重组质粒可以经感受态菌株进行扩增，例如，大肠杆菌感受态菌株hb101。

本发明提供的重组寨卡病毒的基因组rna对应的cdna序列与如上所述的dna分子的序列相同。

本发明提供的构建重组寨卡病毒的方法包括：在寨卡病毒的基因组rna的3’非编码区插入mirna靶序列，使得重组寨卡病毒在在神经系统(特别是脑组织(胚胎脑组织))中的基因拷贝数降低至插入mirna靶序列前的寨卡病毒的10％以下。

本发明中，如前所述，插入的mirna靶序列为能够抑制寨卡病毒复制的mirna靶序列，可以为多种mirna靶序列的串联，优选情况下，所述mirna的靶序列如seqidno：7-12中的任意一种所示，也即seqidno：1-6所示序列中的t替换为u后的序列中的任意一种所示。

ucauacagcuagauaaccaaaga(seqidno：7)

aucaagguccgcugugaacacg(seqidno：8)

ucacagguuaaagggucucaggga(seqidno：9)

ucauacagcuagauaaccaaagacacgucauacagcuagauaaccaaagacacgucauacagcuagauaaccaaaga(seqidno：10)

aucaagguccgcugugaacacgcacgaucaagguccgcugugaacacgcacgaucaagguccgcugugaacacg(seqidno：11)

ucacagguuaaagggucucagggacacgucacagguuuaaagggucucagggacacgucacagguuaaagggucucaggga(seqidno：12)

根据本发明，只要将所述mirna靶序列插入寨卡病毒的3’非编码区即可实现本发明的目的，也即，所述mirna靶序列的插入位置可以为3’非编码区的前端、末端或中间，优选情况下，所述mirna靶序列的插入位点为3’非编码区序列的前端(5’端)。

本发明中，所述寨卡病毒可以为各种常见的寨卡病毒感染性毒株，优选情况下，所述寨卡病毒的基因组rna的序列如genbank编号ku955593所示。

根据本发明一种优选的实施方式，构建所述重组寨卡病毒的方法包括：将如前所述的dna分子或重组质粒进行体外转录，将得到的转录体rna转染敏感细胞。

进一步优选地，所述敏感细胞为bhk-21细胞、vero细胞和c6/36细胞中的至少一种。

本发明还提供了如前所述的dna分子、重组质粒和重组寨卡病毒中的至少一种在预防寨卡病毒感染中的用途，尤其是在制备用于预防寨卡病毒感染的疫苗中的用途，特别是在制备用于预防寨卡病毒感染引起的小头症的疫苗中的用途。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂销售商购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

bhk-21细胞：购自atcc，产品目录号为ccl-10；vero细胞：购自atcc，产品目录号为ccl-81；c6/36细胞：购自atcc，产品目录号为crl-1660；

寨卡病毒(zikv)，也即fss13025株，基因组rna的序列如genbank编号ku955593所示，其感染性克隆质粒的序列如seqidno：14所示；大肠杆菌感受态菌株hb101购买于北京天根生化科技有限公司；实验所用小鼠balb/c、a129购自于军事医学研究院实验动物中心，并饲养于spf环境中，所有动物实验操作均严格按照军事医学研究院微生物与流行病研究所实验动物伦理委员会标准执行；

“室温”指约25℃。

实施例1

重组寨卡病毒的构建和鉴定

本实施例主要利用反向遗传学技术，以寨卡病毒的感染性克隆质粒为骨架，在基因的分子水平上，采用分子克隆技术、融合pcr、转化法等引入外源基因序列，最终获得携带有目的基因的重组寨卡病毒全长克隆质粒，对重组病毒克隆质粒进行线性化、体外转录，所得产物rna中便携带有插入外源序列的感染性病毒基因。将体外转录产物转染至易感细胞内，以此进行恢复重组病毒的拯救。

构建策略如图1所示：在寨卡病毒株fss13025感染性克隆的基础上，于其基因组3’utr前端，即在序列10379nt与10380nt之间插入各个外源mirna靶序列片段，构建携带有mirna靶序列的重组zikv全长感染性克隆，命名为：mirt-9、mirt-124、mirt-125、mirt-9*3、mirt-124*3和mirt-125*3。mirna靶序列的编码序列分别如seqidno：1-6所示，具体构建方法如下所述。

一、寨卡病毒感染性克隆质粒的小量提取

对含有fss13025感染性克隆质粒的hb101菌液进行小提质粒。所用试剂盒为promega公司的plussvminiprepsdnapurificationsystem(promega公司)。具体步骤如下：

1.在超净工作台里，使用无菌的10μl枪头，从琼脂平板上轻轻挑取含有fss13025感染性克隆质粒的单菌落，接种到15ml-25ml含有一磷酸腺苷+的lb培养基中，于摇床中37℃、180rpm培养过夜，一般不超过16h；

2.取培养好的菌液，12000rpm，室温离心2min后弃上层悬液，尽量除去上清；

3.向离心管内加入250μl细胞重悬液(cellresuspensionsolution)，使用移液器吹吸混匀沉淀的菌体，直至其达到完全重悬状态；

4.再向离心管内加入250μl细胞裂解液(celllysissolution)及10μl碱性蛋白酶(alkalineprotease)，充分混匀，使菌体完全裂解，裂解时间不超过5min；

5.向离心管内加入350μlneut.solution，将其温和地上下颠倒翻转数次，直至出现白色絮状沉淀；12000rpm转速下室温离心10min，使其沉淀集中在离心管底部或一侧；

6.使用移液器将上清液轻轻吸出，加入到吸附柱内，12000rpm离心1min，弃去离出液；

7.加入750μlwashbuffer于吸附柱内，12000rpm离心30s，弃去离出液；

8.再加入500μlwashbuffer于吸附柱内，12000rpm离心30s，弃去离出液；12000rpm空离2min，弃去离出液；

9.将吸附柱转移到新的收集管中，加入50μlddh2o，静置2min后，12000rpm离心2min；

10.弃掉吸附柱，收集滤出液，作相关标记并保存在-20℃备用。

二、pcr扩增各分片段序列

将通过小量提取得到的fss13025感染性克隆质粒作为模板，使用high-fidelity2×mastermix聚合酶(neb公司)分别扩增获得s1分片段和s2分片段。所用引物的具体信息如表1所示。

表1

具体方法如下：

1.s1分片段pcr反应体系：

pcr反应参数设置：

第一阶段：98℃，1min；

第二阶段：98℃，10s；55℃，30s；72℃，1min，共30个循环；

第三阶段：72℃，5min。

2.s2分片段pcr反应体系：

由于使用相同的模板和dna聚合酶，所以反应体系同s1分片段pcr反应体系相同。

pcr反应参数设置：

第一阶段：98℃，1min；

第二阶段：98℃，10s；55℃，30s；72℃，45s，共30个循环；

第三阶段：72℃，5min。

pcr反应结束后，对反应产物进行电泳鉴定，并回收目的产物。

三、pcr产物回收

将pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下用小刀切取含有目的dna片段的琼脂糖凝胶，并转移到新的离心管中，使用svgelandpcr回收试剂盒对目的片段进行回收，具体步骤如下：

1.向离心管内加入500μl膜结合缓冲液(membranebindingbuffer)，8000rpm离心30s，使其沉降到离心管底部；

2.将金属浴加热器加热到55℃，把离心后的离心管放入金属浴板孔内，使其内的凝胶溶解，期间取出并反复上下颠倒数次，等待凝胶溶解液后，取出冷却至室温；

3.把离心管内溶解后的混合液转移至试剂盒自带的dna吸附柱内，12000rpm离心1min，弃去废液；

4.向吸附柱内加入已经使用无水乙醇配制好的洗涤液(washbuffer)750μl进行洗涤，12000rpm离心1min，弃去废液；

5.重新洗涤一次，加入洗涤液500μl，12000rpm离心1min，弃去废液；12000rpm空离2min，弃去废液；

6.将dna吸附柱置于新的离心管中，加入50μl无核酸酶水，室温下静置2min，12000rpm离心2min；

7.收集并测定溶液中dna浓度，作相关标记后，于-20℃条件下保存备用。

四、融合pcr方法扩增各目的片段

使用high-fidelity2×mastermix聚合酶对各分片段进行融合，各分片段摩尔比为1:1，具体如下：

1.融合pcr反应体系：

融合pcr反应参数设置：

第一阶段：98℃，1min；

第二阶段：98℃，10s；55℃，30s；72℃，2min15s，共10+30个循环；

第三阶段：72℃，5min。

2.pcr反应阶段：

融合pcr反应10个循环后，结束反应。向每个反应体系中加入引物f1和r2(引物序列见表1)各1μl。更改上述融合pcr反应参数设置中10个循环为30个循环，继续进行pcr反应直至结束。融合pcr反应产物的纯化回收方法为：

(1)向pcr体系中加入3倍体积的膜结合缓冲液，混匀后加入吸附柱中，其12000rpm离心1min，弃掉废液；

(2)加入洗涤液750μl；12000rpm离心1min，弃掉废液；

(3)重复洗涤一次，加入洗涤液500μl，12000rpm离心1min，弃去废液；

(4)12000rpm空离2min，弃去废液；

(5)将吸附柱置于新的离心管中，加入50μl无核酸酶水，在室温环境下，静置2min，12000rpm离心2min；

(6)收集并测定溶液中融合片段浓度，作相关标记后，于-20℃条件下保存备用。

五、双酶切质粒及融合片段

将融合pcr产物与经小量提取得到的fss13025质粒分别用限制性内切酶ecori-hf和clai进行酶切反应，反应体系为：

将反应体系置于37℃水浴锅内，反应4h。对反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果正确则使用pcr产物纯化试剂盒进行回收酶切产物及载体。具体方法同上述步骤四。回收产物作相应标记后，于-20℃条件下保存备用。

六、连接酶切产物和载体

将纯化后所得的酶切产物首先使用nd100分光光度计进行浓度测量，然后将载体与融合片段按照摩尔比为1:5进行连接反应。反应体系为：

将配制好的各连接体系混匀后，低速2000rpm离心30s，然后把各连接体系置于4℃冰箱中过夜反应。

七、转化连接产物至hb101感受态菌株

1.从-80℃冰箱取出hb101感受态菌株，冰上放置10min使其融化；

2.在超净工作台中，用移液器将含有质粒的连接体系加入到hb101感受态菌株中，充分混合均匀，转化体系冰上放置30min；

3.打开水浴锅，温度设置42℃，达到温度后，将转化体系水浴热激90s后快速取出，冰上放置2min；

4.使用移液器向转化体系中加入500μl无一磷酸腺苷的lb培养基，然后吹打均匀，37℃180rpm摇床培养1h；

5.转化体系在摇床活化期间，将含有氨苄的lb固体培养基放置于37℃孵箱，使其升温活化30min；

6.转化体系活化结束后，将其5000rpm离心5min，弃去部分上清，使转化体系内保持250-300μl液体，然后吹打均匀，用灭菌棒将其涂布于固体lb培养皿上；

7.将已涂布的含转化体系的固体lb培养皿放置在摇床30℃培养18h。

八、克隆挑取与鉴定

1.用吸管取5ml含有氨苄的lb液体培养基，加入无菌试管中，在试管上做相应标记待用；

2.在超净工作台内，将含氨苄固体lb培养皿上生长到恰当大小的细菌克隆，用10μl移液器枪头挑取单个克隆，放入已标记的试管中生长；

3.挑克隆结束后，将各试管放于摇床内，30℃180rpm摇菌培养约17h；

4.取少量菌液用重组片段两侧的测序引物进行pcr反应，反应体系如下：

pcr反应程序如下：

第一阶段：95℃，5min；

第二阶段：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min，共30个循环；

第三阶段：72℃，5min。

5.取3μlpcr产物琼脂糖凝胶鉴定。选取片段大小正确的pcr样品进行测序鉴定；

6.用质粒小提试剂盒提取测序正确的质粒(也即分别含有第10379与10380位碱基之间插入了mirna靶序列的编码序列的ku955593序列)，酶切鉴定质粒的正确性；

7.将测序与酶切鉴定均正确的菌液-80℃保存。

九、菌液的扩大培养

1.lb液体培养基的配制：

(1)称取酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，将它们倒入3l的大锥形瓶中，加入1l去离子水，充分溶解；

(2)使用250ml的量筒，将其分装于500ml的无菌生理盐水瓶中，每瓶250ml，盖好瓶盖；

(3)将分装好的lb培养基放入高压灭菌箱中，121℃30min高压灭菌；

(4)待灭菌结束，温度降到30℃以下时，以1:1000的比例加入氨苄青霉素，充分混匀，4℃冰箱保存以备用。

2.接种菌液

(1)根据测序结果，选择含有目的基因的菌液，加入事先标记好的lb瓶内，每瓶加菌液200μl，剩余菌液作为保菌；

(2)接种菌液以后，将瓶子放入摇床内，180rpm37℃培养约17h。

十、质粒提取、线性化及酚氯仿抽提

1.使用质粒提取试剂盒(invitrogen公司)制备质粒：

(1)平衡：30ml平衡液eq1直接加入套管中；

(2)收集：菌液8000rpm离心5min；

(3)悬浮：在套管中加入10mlr3(混有rnasea)，吹打菌液均匀；

(4)裂解：加入10ml裂解液l7，反转离心管数次至澄清；

(5)沉淀：加入10mln3，摇晃至出现大量沉淀，9000rpm离心10min；

(6)澄清：将离心产物全部转入柱内，待液体虑尽，加入10mlw8洗涤；

(7)漂洗：弃掉里层滤网，加入50mlw8洗柱子；

(8)洗脱：更换干净离心管，接e4洗出液，加入15mle4至柱内，待液体流尽；

(9)向离心管中加入10.5ml异丙醇，4℃离心，8000rpm离心80min；

(10)弃去上清，加入1.5ml70％乙醇，转入小ep内，12000rpm离心10min；

(11)弃上清，加入300μl56℃双蒸水溶解沉淀，测浓度。

2.质粒线性化处理：

(1)材料准备阶段：将质粒、10×buffer、h2o从-20℃冰箱内取出来，室温溶解，clai酶放于4℃待用；

(2)各反应成分融化后，按下列配制反应体系液：

(3)将水浴锅打开，温度设定为37℃；

(4)待水浴锅达到所需温度后，将以配制好的各反应体系放入，水浴4h；

(5)各反应结束后，使用琼脂糖凝胶电泳方法对反应产物进行鉴定；

(6)线性化产物做好相应标记，并于-20℃保存。

3.线性化产物酚氯仿抽提

(1)将线性化产物从-20℃冰箱取出，室温溶解；

(2)向溶解的各个线性化产物中补加水，使之总体积达到300μl，充分混匀，制成样品；

(3)按照1:1的比例配制酚氯仿混合液，将配制好的酚氯仿混合液300μl等体积加入到各个样品中；

(4)将各反应体系放入离心机内，13000rpm离心10min；

(5)取出各反应体系，用移液枪吸取上清至新的标记好的离心管中；

(6)加入30μl醋酸钠溶液混匀，再加入750μl无水乙醇充分混匀；

(7)放在-80℃冰箱中沉降30钟；

(8)沉降结束，13000rpm离心15min，然后弃去上清；

(9)向离心管中加入600μl70体积％乙醇洗两次，13000rpm离心15min，弃上清；

(10)将洗涤后的产物风干沉淀，然后加入30μl的水溶解，并测其含量，做好相应标记。

十一、重组病毒克隆质粒的体外转录

1.准备阶段：将质粒线性化产物及t7体外转录试剂盒(购自promega公司)从冰箱内取出，室温下溶解；提前打开水浴锅，温度设定在37℃；

2.各反应体系配制，具体如下：

3.将各反应体系按上表配制好后，放入水浴锅内，孵育4h；

4.孵育时间结束后，取出各反应体系，向各反应体系中加入2.5μl的rnase-freednaseⅰ。然后放入水浴锅内，37℃继续孵育20min；

5.孵育结束，反应体系产物使用琼脂糖凝胶电泳鉴定rna条带；

6.获得的体外转录产物存放于-80℃冰箱备用，做好相关记录。

十二、体外转录产物的转染及恢复病毒拯救

1.使用移液器取125μl的opti-mem培养基加入到ep管中，加入30μl体外转录产物(rna)，充分混匀，室温放置5min；

2.再次使用移液器取125μl的opti-mem培养基加入到另一ep管中，加入7.5μllipo-3000，充分混匀，室温放置5min；

3.5min室温反应后，将上述两种反应液混匀，室温放置30min；

4.30min后，将上述反应液加入到6孔板bhk-21细胞中，并补加opti-mem培养基使总体积达到2ml；

5.设置阳性和阴性对照：

阳性对照：250μlopti-mem+7.5μllipo-3000+30μlrna(fss13025)

阴性对照：250μlopti-mem+7.5μllipo-3000

6.放入37度孵箱，孵育6h。然后弃去上清，使用pbs清洗一次，更换2％fbs的dmem病毒维持液培养基；

7.每日观察细胞病变情况，大约4天，取病变细胞上清200μl，用rna小提试剂盒提取rna，进行rt-pcr并测序鉴定；

8.冻存剩余的6孔板细胞上清液，冻融后收集病毒液，并分装标记；

9.将测序正确的病毒上清液-80℃保存待用。

十三、恢复病毒基因组的rt-pcr鉴定

1.按照rnaminikit试剂盒(购自invitrogen公司)的说明，对恢复病毒进行基因组rna提取，操作方法如下：

(1)先配制含有1％β-巯基乙醇的lysisbuffer；

(2)吸取200μl病毒液放入ep管中，加入等体积的上述lysisbuffer，充分混匀；

(3)每个ep管中加入200μl的无水乙醇，充分混匀；

(4)将ep管中的溶液转入吸附柱内，室温静置2min；

(5)将吸附柱放入离心机中，12000rpm离心15s；

(6)弃去吸附柱收集管内的流出液，然后向吸附柱内加入700μlwashbufferⅰ,转入离心机中，12000rpm离心15s；

(7)弃去收集管中的流出液，每个管柱内加500μlwashbufferⅱ，转入离心机中，12000rpm离心15s；

(8)重复操作7一次；

(9)弃去收集管内流出液，放入吸附柱，12000rpm离心2min；

(10)每个吸附柱内加入50μl的rnase-freewater，室温静置2min，转入离心机中，12000rpm离心2min；

(11)弃去吸附柱，在新的收集产物ep管上做好相应标记，-20℃保存备用。

2.对提取的病毒rna进行rt-pcr，鉴定靶序列是否存在。具体方法如下：

(1)反应体系配制：

(2)pcr仪参数设置：

第一阶段：55℃，30min；

第二阶段：94℃，2min；

第三阶段：94℃，15s；55℃，30s，68℃，1min，共40个循环；

第四阶段：68℃，5min。

(3)对pcr产物用f-4s引物(cttgggcgaagaagggtccacacct，seqidno：29)进行测序，并对测序结果进行序列比对。

实施例2

恢复病毒的间接免疫荧光荧光实验

将实施例1制备的重组病毒进行如下操作，并使用野生型寨卡病毒(fss13025，wt)作阳性对照：

1.将生长状态良好的单层致密bhk-21细胞用胰酶消化后，传至预先放置玻璃爬片的24孔细胞培养板中，37℃5％co2孵箱内培养至细胞量达到细胞板底部总面积的80％后，移去上清液；

2.将恢复的重组病毒接种于其中，moi＝0.1，37℃5％co2孵箱内培养1h，弃去病毒液，每孔加入500μl病毒液，在孵箱中继续培养；

3.24、48h后，分别将长有细胞的玻璃盖玻片取出，用甲醛丙酮混合液室温固定30min，然后弃去固定液，使用pbs生理缓冲液清洗干净固定液。制作好的抗原片放置于-20℃保存备用。同时标记接种野生型毒株的细胞作为阳性对照，未接种病毒的细胞作为阴性对照；

4.间接免疫荧光实验操作：

(1)将寨卡病毒e蛋白抗体作为一抗加入抗原片的孔内，放入37℃孵箱孵育1h，然后取出弃去一抗，使用pbs生理缓冲液在细胞版振荡器上振荡清洗，每次洗涤5min，共三次。

(2)洗涤结束后，加入二抗alex-fluor488标记羊抗鼠抗体(北京中杉金桥公司)，放入37℃孵箱孵育1h，然后取出弃去一抗，使用pbs生理缓冲液在细胞版振荡器上振荡清洗，每次洗涤5min，共三次。

(3)最后，使用dapi染料温染细胞核5min，pbs生理缓冲液清洗后在荧光显微镜下观察并拍照记录。

注：一抗(4g2)1:1000用pbs生理缓冲液稀释；二抗1:200用pbs生理缓冲液稀释；dapi1:1000用去离子水稀释。

结果见图2。重组病毒感染的bhk-21细胞均呈现特异荧光，且随着感染时间的增加，重组病毒特异蛋白表达量能够和wt株一样逐渐增加。这表明，本发明构建的重组病毒可在细胞中正常复制并能够有效表达病毒株的e蛋白。

实施例3

重组病毒的空斑特征

将实施例1制备的重组病毒和野生型寨卡病毒(fss13025)进行如下操作：

1.用细胞维持液将病毒10倍比稀释，如1:10、1:100、1:1000、1:10000；

2.在单层致密的细胞培养板中，加入1ml不同稀释度的病毒悬液，37℃5％co2孵箱内培养1h，期间轻轻摇动两次；

3.弃去病毒液，每孔加入1ml适当温度(37℃)溶化的琼脂盖营养培养基(2％琼脂糖+2×dmem细胞维持液按1:1充分混合)，37℃继续培养；

4.每天观察，当细胞出现明显的病变现象时，从培养箱中取出细胞培养板；

5.每孔加入1ml左右的固定液，室温固定1h，弃去固定液和营养琼盖，清水冲洗3次；

6.每孔加入1.5％结晶紫溶液1ml，室温染色30min，弃去结晶紫染液，清水冲去残余，待晾干计算出斑数并拍照；

7.噬斑形成单位(pfu)＝(平均出斑数*病毒稀释度)/接种病毒剂量，病毒滴度以pfu/ml表示。

结果见图3。在bhk-21细胞上能够产生明显的空斑，与亲本病毒形态相比，重组株病毒mirt-124、mirt-124*3和mirt-125*3的噬斑明显变小，说明本发明构建的重组病毒具有感染性，部分重组病毒还表现出小斑特征。

实施例4

重组病毒的在不同细胞内的增殖特征

将实施例1制备的重组病毒和野生型寨卡病毒(fss13025)进行如下操作：

1.将长满单层的bhk-21、vero和c6/36细胞传代至24孔板，每孔加入500μl细胞悬液；

2.将24孔板放置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养24h至细胞长满80％左右；

3.用含2％fbs的dmem培养液稀释病毒液，病毒按照moi＝0.1接种于24孔板的各孔内，在37℃、5％co2的恒温培养箱孵育1h；

4.吸出病毒液，每孔补加500μl含2％fbs的dmem病毒维持液，在恒温培养箱中继续孵育，24h，48h，72h，96h等不同时间点取细胞上清液，分装，样品保存在-80℃冰箱中；

5.用q-pcr法测定不同时间点时的病毒rna拷贝数，并绘制病毒生长曲线。

结果见图4。重组病毒mirt-124*3和wt株在三种细胞系中的复制能力无差异。这说明插入3拷贝mirt-124靶序列并不影响重组病毒的复制能力，仍能达到与亲本株相近的水平。

实施例5

重组病毒在乳鼠颅内复制情况的评价

将实施例1制备的重组病毒(mirt-124*3)和野生型寨卡病毒(wt)进行如下操作：

将1日龄balb/c1乳鼠16只随机分为2组，每组8只。将wt和mirt-124*3毒株以5000pfu/只滴度接种乳鼠颅内。于攻毒后第3、6、9天取各组乳鼠鼠脑，研磨后离心获得上清，实时定量检测病毒rna拷贝数。绘制复制曲线。

结果见图5。可以看出重组病毒在颅内的复制是受限的，说明重组病毒的增殖在脑组织中受到mirna的干扰。

实施例6

重组病毒在成鼠脏器的分布

将实施例1制备的重组病毒(mirt-124*3)和野生型寨卡病毒(wt)进行如下操作：

取4周a129雌性小鼠，称重后，按照体重进行随机分组，每组6只，共2组12只。将wt以及mirt-124*3毒株使用pbs分别稀释至10⁶pfu/ml，按照100μl/只的剂量通过腹腔途径感染小鼠。分别于1、2、3天连续尾部取血，并于感染后第3天，处死小鼠，分别对每只小鼠取脑、心、肝、脾、肺、肾，称重后贮存备用。对血清和各脏器提取rna，实时定量检测病毒rna拷贝数，并绘制曲线图。

结果见图6。根据实验结果可以看出重组病毒与亲本株在外周血中的基因拷贝数在感染后1和2天无明显差异。与野生病毒相比，重组病毒只在脑组织中的复制能力显著降低，提示可能是脑组织中的特异mirna靶向降解重组病毒基因组所致。

实施例7

重组病毒的神经毒力特征

将实施例1制备的重组病毒(mirt-124*3)和野生型寨卡病毒(wt)进行如下操作：

取1日龄balb/c乳鼠56只，随机分为7组。将重组病毒与wt毒株按5000pfu/只的剂量，以颅内接种方式将病毒注射到乳鼠脑内，每天观察乳鼠发病情况和死亡状况并进行记录统计。

结果见图7(a-c)。此剂量下接种亲本株乳鼠组在第15天已全部死亡，mirt-9、mirt-9*3、mirt-125*3组各死亡一只，mirt-124、mirt-124*3、mirt-125组完全存活。这说明与亲本株相比，重组病毒株组的神经毒力均显著减弱。

实施例8

重组病毒免疫诱导中和抗体效价

将实施例1制备的重组病毒(mirt-124*3)和野生型寨卡病毒(wt)进行如下操作：

采用50％蚀斑减少中和实验(prnt50)法检测嵌合病毒免疫后小鼠血清中针对wt中和抗体效价。具体方法为：

1.传bhk-21细胞于12孔板中，待细胞长至90％左右；

2.用pbs将之前收集的小鼠血清按照1:8，1:16，1:32进行2倍倍比稀释；

3.取细胞制备的wt病毒液，使用pbs稀释至终浓度为500pfu/ml，并取120μl病毒液与等体积的稀释血清混匀，37℃孵育1h；

4.将病毒-血清混合液接种到bhk-21细胞上，每孔200μl，37℃，吸附1h；

5.移去病毒-血清混合液，pbs清洗两次后，补加1ml含有1％低熔点琼脂糖和2％fbs的dmem培养液，继续培养；

6.接种4天后，固定噬斑并染色，方法同噬斑实验。

7.统计每孔的噬斑数计算出病毒滴度。血清中和抗体滴度以产生50％噬斑减少的血清稀释度的倒数为终点。

结果见图8。显示重组病毒mirt-124*3能够诱导小鼠产生中和抗体，中和抗体效价在1:25左右。这说明使用mirt-124*3免疫小鼠能够诱导具有保护性的中和抗体产生。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>携带特异mirna靶序列的重组寨卡病毒及其应用

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