一种定位基因组DNA上损伤和修饰位点的方法与流程

本发明属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种用于精确定位基因组dna上损伤和修饰位点的方法。

背景技术：

dna分子作为生物体遗传信息的携带者，其完整性是细胞繁殖和行使正常生理功能的物质基础。然而，多种外界环境和生物体内部的因素都会导致dna分子的损伤或改变，如紫外线、辐射、致癌性化学物质、细胞自身代谢过程中产生的氧化压力等。如果dna的损伤或遗传信息的改变不能及时得到修复，就可能影响细胞的正常生理或遗传功能，如细胞癌变、遗传疾病等。因此，生物体尤其高等生物进化出了一套复杂而完整的dna修复系统，即生物体dna分子一直处于损伤－修复的动态过程中。深入理解这一动态过程对于阐明癌症发生、遗传疾病机理等具有重要的理论基础和指导意义。然而，目前所有检测和定位dna损伤／修饰发生位点的方法，均基于免疫共沉淀技术，该类方法具有样品用量大、实验成本高、抗体获得难、准确率低、背景高、分辨率低（大于300bp）等局限性，导致这类方法无法应用于临床研究和开发。截至目前，还没有技术可以实现精确定位dna损伤发生位点，导致人们无法进一步研究细胞内生理水平的dna损伤－修复的动态过程，进而限制了将dna自修复系统应用于细胞治疗，分子诊断，基因治疗等临床应用。

由于临床实验中多数为珍稀样品，开发一种高灵敏度、高分辨率定位dna损伤／修饰的方法，将极大的推动dna损伤－修复过程、癌症发生机理及预防、药物安全性评估、基因治疗、遗传疾病等领域的科学研究和临床应用。

技术实现要素：

针对现有技术中实验成本高、准确率低、背景高、分辨率低的问题，本发明提供了一种精确定位基因组dna上损伤和修饰位点的方法，能够实现对不同长度和不同来源的dna样品上的损伤和修饰进行检测及单核苷酸水平的定位。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种定位基因组dna上损伤和修饰位点的方法，包括以下步骤：

（1）将dna样品的损伤和修饰位点转化为断裂位点；

（2）步骤（1）获得样品加入硫代核苷酸和dna聚合酶i进行切口平移，以实现对损伤或修饰位点进行标记，同时实现对位点下游dna序列进行磷硫酰化修饰替换；

（3）利用对磷硫酰化修饰dna敏感的核酸酶，处理步骤（2）终止反应后的样品，消除模板dna，获得纯化的磷硫酰化修饰dna；

（4）对步骤（3）中获得的磷硫酰化修饰dna进行高通量测序，所得序列的5'端即为原损伤或者修饰位点。

所述dna样品来源不限，可以是动物、植物或微生物；可以根据样品的不同而采用本领域内常用的dna提取方法，如酚抽提法、异丙醇沉淀法、ctab法等，也可以使用商业化的试剂盒。

所述步骤（1）中的转化方法为通过酶或化学试剂转化成断裂位点；所述酶为常用的dna修复酶或去修饰酶，如，处理嘌呤氧化损伤的fpg、处理尿嘧啶的udg、处理ap位点的endonucleaseiv、处理碱基错配的muts，去甲基化酶tet，处理5mc修饰位点的tdg等；所述化学试剂，如，碘处理切割天然磷硫酰化修饰位点。

所述步骤（3）中的终止方法为高温灭活酶。

所述步骤（3）中核酸外切酶为对磷硫酰化修饰dna敏感的核酸酶；如核酸酶p1，核酸外切酶iii，recj或几种酶的组合。

作为优选，步骤（3）还包括对反应后样品的纯化处理。

优选地，步骤（3）包括如下步骤：加入磷硫酰化修饰dna敏感的核酸酶，如1u核酸酶p1，50℃反应1小时；或者10u核酸酶iii和recj混合物，37℃反应1小时。

所述步骤（4）中测序选自但不限于sanger测序、illumina测序。对含有单个损伤位点的样本进行sanger测序，对含有多个损伤位点的样本进行illumina测序。

优选地，步骤（4）还包括如下步骤：将磷硫酰化修饰dna片段转化为双链dna后，再经pcr扩增后，产物用于illumina测序。

本发明的原理如下：

首先将dna样品的损伤或修饰位点转化为断裂位点；然后通过切口平移技术将断裂位点及其下游序列转化为磷硫酰化修饰的dna；之后通过对磷硫酰化修饰dna敏感的核酸酶将模板dna消化，磷硫酰化修饰的dna可以抵抗核酸酶水解而得以保留，对模版消化后的磷硫酰化修饰dna进行纯化，消除背景影响；然后将剩余的磷硫酰化修饰的dna进行测序，测序所得序列的5'端即为原损伤或者修饰位点。

本发明具有以下优点：

本发明提供的用于dna损伤和修饰位点精确定位的方法，能够实现对不同长度和不同来源的dna进行损伤和修饰位点定量和定位分析，使用简便，易于操作，而且对样品无特殊要求，准确率高；检测背景影响低、分辨率高，可广泛应用于临床分子诊断、化疗药物安全评估、癌症发生及预防、分子生物学研究、基因治疗等诸多领域。

附图说明

图1是dna损伤和修饰位点精确定位的流程示意图；

图2是精确定位短链dna断裂位点检测结果图；

图3是精确定位短链dna损伤位点检测结果图；

图4是精确定位基因组dna断裂损伤位点检测结果图；

图5是精确定位基因组dna磷硫酰化修饰位点检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1定位短链dna断裂位点

1.通过dna合成公司（idt公司,美国）合成含有100bp的dna双链片段，正义链序列为：

actggggccagatgcgtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtag，下标为dna单链内切酶nb.bsrdi位点；

2.单链酶切dna片段：50μl反应体系中含有：10单位的单链内切酶nb.bsrdi（neb,美国），5μl缓冲液（nebcutsmartbuffer)，1μgdna低物，用水补足50μl。65℃反应1h后，80℃灭活20min；

3.断点标记：向反应液中加入2μl硫代修饰核苷酸（10mm,trilink)，1μldna聚合酶i，15℃反应1小时，65℃10min终止反应；

4.模板消除：向反应液中加入10单位的核酸外切酶iii(neb)以及10单位的核酸外切酶recj(neb)，37℃反应1个小时；

5.纯化标记dna片段：利用zymodna纯化试剂盒，向反应产物中加入100μl结合液，400μl无水乙醇，充分混合后过柱，750μlwashbuffer冲洗一次后，用20μl洗脱液洗脱；

6.送与测序公司进行sanger测序（genewiz)，测序所得的5’端序列如图2所示，即为断裂位点。

实施例2定位短链dna损伤（uracil)位点

1.通过dna合成公司（idt公司,美国）合成含有100bp的dna双链片段，正义链序列为：

actggggccagatgugtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtag，下标为dna损伤（uracil)位点；

2.酶切dna损伤位点：50μl反应体系中含有：10单位的uracil修复酶udg和内切酶iv（neb,美国），5μl缓冲液（nebcutsmartbuffer)，1μgdna低物，用水补足50μl。37℃反应1h后，75℃灭活20min；

3.断点标记：向反应液中加入2μl硫代修饰核苷酸（10mm,trilink),1μldna聚合酶i，15℃反应1小时，65℃10min终止反应；

4.模板消除：向反应液中加入10单位的核酸外切酶iii(neb)以及10单位的核酸外切酶recj(neb)，37℃反应1个小时；

5.纯化标记dna片段：利用zymodna纯化试剂盒，向反应产物中加入100μl结合液，400μl无水乙醇，充分混合后过柱，750μlwashbuffer冲洗一次后，用20μl洗脱液洗脱；

6.送测序公司进行sanger测序（genewiz)，测序所得的5’端序列如图3所示，即为损伤位点。

实施例3定位基因组dna断裂位点

1.在10mllb培养液中37℃过夜培养大肠杆菌dh10b菌株。收集1ml菌体，用omegabacterialdnaextractionkit(omega公司，美国）提取基因组dna，方法按照产品说明进行；

2.酶切dna断裂位点：50μl反应体系中含有：10单位的dna单链缺口酶nb.bsrdi（neb,美国），5μl缓冲液（nebcutsmartbuffer)，1μg基因组dna低物，用水补足50μl。37℃反应1h后，75℃灭活20min；

3.断点标记：向反应液中加入2μl硫代修饰核苷酸（10mm,trilink)，1μldna聚合酶i，15℃反应1小时，65℃10min终止反应。

4.模板消除：向反应液中加入10单位的核酸外切酶iii(neb)以及10单位的核酸外切酶recj(neb)，37℃反应1个小时；

5.纯化标记dna片段：利用zymodna纯化试剂盒，向反应产物中加入100μl结合液，400μl无水乙醇，充分混合后过柱，750μlwashbuffer冲洗一次后，用20μl洗脱液洗脱；

6.构建illumina文库：步骤5中洗脱所得dna，利用clontechsmartchip-seq试剂盒构建dna文库，按照试剂盒说明书进行：加入1mm接头dna和mml病毒逆转录酶，50℃反应2小时，70℃10min终止反应；然后pcr扩增，95℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸30s；15个循环，产物送测序公司进行illumina测序；

7.illumina测序数据分析：将测序所得的数据，对大肠杆菌基因组进行匹配，reads集中区的5’端如图4所示，即为断裂位点。

实施例4定位基因组dna磷硫酰化修饰位点

1.在10mllb培养液中37℃过夜培养大肠杆菌b7a菌株。收集1ml菌体，用omegabacterialdnaextractionkit(omega公司，美国）提取基因组dna，方法按照产品说明进行；

2.碘切割dna磷硫酰化修饰位点：50μl反应体系中含有：50mmph9.0缓冲液，2μl碘液，1μg基因组dna底物，用水补足50μl。65℃反应10min。反应液用qiagendyeex脱盐柱纯化；

3.断点标记：向qiagendyeex洗脱产物中，加入2μl硫代修饰核苷酸（10mm,trilink)，1μldna聚合酶i，15℃反应1小时，65℃10min终止反应；

4.模板消除：向反应液中加入10单位的核酸外切酶iii(neb)以及10单位的核酸外切酶recj(neb)，37℃反应1个小时；

5.纯化标记dna片段：利用zymodna纯化试剂盒，向反应产物中加入100μl结合液，400μl无水乙醇，充分混合后过柱，750μlwashbuffer冲洗一次后，用20μl洗脱液洗脱；

6.构建illumina文库：同实施例3中步骤6；

7.illumina测序数据分析：将测序所得的数据，对大肠杆菌基因组进行匹配，reads集中区的5’端如图5所示，即为断裂位点。