本发明涉及植物组培和微生物发酵技术，具体的涉及一种促进紫皮石斛种子萌发的真菌诱导子及其制备方法与应用。
背景技术：
在自然条件下，兰科植物种子没有胚乳，不能正常萌发，其必须与菌根真菌建立共生关系，才能完成其正常的生长发育。真菌诱导子是来源于真菌的一种确定的化学信号，在植物与真菌的相互作用中，能快速、高度专一和选择性的诱导植物特定基因的表达，进而活化特定次生代谢途径，积累特定目的的次生代谢产物，从而为植物种子萌发和生长提供特殊的营养物质。
目前在紫皮石斛组培上应用真菌诱导子促进种子萌发繁育种苗还未见报道。
技术实现要素：
发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明的目的之一是提供所述真菌诱导子及其制备方法，本发明的目的之二是提供利用该真菌诱导子促进紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法。
技术方案：本发明所述的一种真菌诱导子的制备方法，由尖孢镰刀菌制备得到，包含以下步骤：将尖孢镰刀菌接种于pda平板上培养，取菌饼接种于培养基中发酵培养，发酵培养结束后将发酵液和菌丝粉碎后灭菌即得；所述尖孢镰刀菌为尖孢镰刀菌jsnl008-1，保藏编号为cgmccno.13688。上述尖孢镰刀菌jsnl008-1具体内容详细记载于专利cn106978358a。
一般情况下，将尖孢镰刀菌接种于pda平板上培养8～10d。
其中，所述发酵培养基为燕麦4～8g/l、葡萄糖20～30g/l、马铃薯80～120g/l、酵母粉5～10g/l，ph5.8～6.4。所述发酵培养为震荡培养，转速为120～160r/min，培养温度为25～30℃，时间为15～20d。
根据上述制备方法制备所得真菌诱导子也在本发明的保护范围内。
上述真菌诱导子在促进紫皮石斛种子萌发中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明所述的一种促进紫皮石斛种子萌发繁育种苗的培养基，包含上述的真菌诱导子，还包括：n6基础培养基+花宝3号5～20g/l+蔗糖25～30g/l+琼脂4.5～6.5g/l+土豆20～50g/l+香蕉80～120g/l；其中，所述真菌诱导子的浓度为100～200ml/l。
进一步优选的，所述真菌诱导子的浓度为100～120ml/l。
上述培养基中，花宝3号为美国花宝(hyponex)公司生产，货号为hyponexno.3。土豆和香蕉是去皮后用料理机粉碎成泥状加入。花宝3号主要为紫皮石斛种子萌发和生长提供必要的n、p、k等大量元素以及相关的微量元素；土豆中淀粉含量丰富，可以为紫皮石斛种子萌发和生长提供碳源，另外土豆中含有一定的植物激素，能促进紫皮石斛种子的萌发，土豆中还含有一定的过氧化物酶、超氧自由基岐化酶以及维生素c，可以防止空气中过多的氧气，产生氧负离子对组培植物造成伤害；香蕉中含有大量的糖类，紫皮石斛生长提供碳源，并且，在香蕉中含有植物激素，比如细胞分裂素，生长素，乙烯和赤霉素，能促进紫皮石斛种子萌发和生长。
本发明所述的一种利用真菌诱导子促进紫皮石斛种子萌发种苗快繁的方法，将紫皮石斛种子播撒于上述培养基中培养，得组培苗。培养条件为：温度25±3℃、光照1200～2500lx、光照时间10～14h/d、培养时间150～180d。
播种前，紫皮石斛种子进行消毒处理。
优选的，培养条件为：紫皮石斛种子播种后，在培养过程中，播种后60～70天，温度控制在22～25℃、光照控制在1200～1600lx、光照时间控制在10～12h/d，待种子萌发成2cm高的小苗后，温度调整为25～28℃、光照调整为1600～2500lx、光照时间调整为12～14h/d培养90～110天即得可移栽的成品组培苗。
有益效果：本发明利用保藏编号cgmccno.13688的尖孢镰刀菌，将其制备成真菌诱导子，应用于紫皮石斛种子无菌播种阶段，加入紫皮石斛种子萌发培养基中，替代其他人工激素，能一次成苗，对比原有生产流程，能大大缩短紫皮石斛组培苗生产周期，节约大量的生产成本，应用前景广阔。
有益效果：本发明利用保藏编号cgmccno.13688的尖孢镰刀菌，将其制备成真菌诱导子，应用于紫皮石斛种子无菌播种阶段，加入紫皮石斛种子萌发培养基中，替代其他人工激素，能一次成苗，对比原有生产流程，紫皮石斛组培苗的生长周期从11个月缩短至6个月，生产成本降低60％，应用前景广阔。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明内容。
菌株来源：在江西省鹰潭市铁皮石斛栽植区内生长状况较好的植株上分离筛选得到菌株jsnl008-1。筛选和分离方法同专利cn106978358a。
花宝3号为美国花宝(hyponex)公司生产，货号为hyponexno.3。
实施例1
一种利用真菌诱导子进行紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法，包括以下步骤：
(1)真菌诱导子的制备：尖孢镰刀菌jsnl008-1接种在pda平板培养基上培养10天后用打孔器打孔制成菌饼，并将菌饼接种到预先分装、灭菌好的燕麦5g/ll+葡萄糖30g/l+马铃薯100g/l+酵母粉8g/l+ph5.8的液体培养基中，在摇床上(130r/min，26℃)震荡培养15天，待真菌充分发酵后，用搅拌机将发酵液和菌丝球粉碎成均一的混合液，并在121℃下灭菌20min，冷却后置4℃冰箱中保存备用。
(2)按照如下组份进行种苗快繁培养基的配置：将步骤(1)中的真菌诱导子100ml/l+n6基础培养基+花宝3号10g/l+30g/l蔗糖+5g/l琼脂+50g/l土豆+100g/l香蕉，ph5.8，在121℃下灭菌20min备用。土豆和香蕉是去皮后用料理机粉碎成泥状加入。
(3)紫皮石斛种子播种进行种子萌发和种苗繁育：将紫皮石斛蒴果依次用70％酒精、0.1％升汞、无菌水进行消毒处理，在无菌条件下切开蒴果取出紫皮石斛种子，将种子均匀播撒在步骤(2)的培养基中，在温度23℃、光照1200lx、光照时间8h/d的培养室内培养60天后，待种子萌发成2cm高的小苗后，将温度调整为28℃、光照调整为2200lx、光照时间调整为14h/d培养120天即得可移栽的成品组培苗。
实施例2
一种利用真菌诱导子进行紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法，包括以下步骤：
(1)真菌诱导子的制备：尖孢镰刀菌jsnl008-1接种在pda平板培养基上培养10天后用打孔器打孔制成菌饼，并将菌饼接种到预先分装、灭菌好的燕麦8g/l+葡萄糖25g/l+马铃薯100g/l+酵母粉10g/l，ph6.0的液体培养基中，在摇床上(150r/min，26℃)震荡培养20天，待真菌充分发酵后，用搅拌机将发酵液和菌丝球粉碎成均一的混合液，并在121℃下灭菌20min，冷却后置4℃冰箱中保存备用。
(2)按照如下组份进行种苗快繁培养基的配置：将步骤(1)中的真菌诱导子120ml/l+n6基础培养基+花宝3号10g/l+30g/l蔗糖+5g/l琼脂+50g/l土豆+100g/l香蕉，ph5.8，在121℃下灭菌20min备用。土豆和香蕉是去皮后用料理机粉碎成泥状加入。
(3)紫皮石斛种子播种进行培养生产种苗：将紫皮石斛蒴果依次用70％酒精、0.1％升汞、无菌水进行消毒处理，在无菌条件下切开蒴果取出紫皮石斛种子，将种子均匀播撒在步骤(2)的培养基中，在温度24℃、光照1500lx、光照时间10h/d的培养室内培养50天后，待种子萌发成2cm高的小苗后，将温度调整为30℃、光照调整为2500lx、光照时间调整为12h/d培养130天即得可移栽的成品组培苗。
实施例3
一种利用真菌诱导子进行紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法，紫皮石斛种子萌发繁育种苗培养基中，真菌诱导子添加量为200ml/l，其他同实施例2。
对比例1
一种利用真菌诱导子进行紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法，紫皮石斛种子萌发繁育种苗培养基中，真菌诱导子添加量为0，其他同实施例2。
结果检测
种子播种180天后测定实施例1、2、3和对比例1的种苗直径，种苗平均株高及叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量。
表1
从表1中可知，由尖孢镰刀菌jsnl008-1制备而成的真菌诱导子添加到紫皮石斛种子萌发繁育种苗的培养基中，能显著促进紫皮石斛种子萌发和生长，种子播种180天后，实施例1、2、3、中的紫皮石斛已形成了较粗壮的、较高的种苗，基本达到了组培苗移栽的要求，而对比例1的对照茎粗只有0.18mm，株高仅4.73cm，未达到可移栽的规格。从叶绿素含量来看，添加了真菌诱导子的培养基能显著提高叶绿素含量，进而促进其生长。由此可见，本发明方法使得紫皮石斛组培苗的生长周期从11个月缩短至6个月，生产成本降低60％，应用前景广阔。
实施例4
一种利用真菌诱导子进行紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法，包括以下步骤：
(1)真菌诱导子的制备：尖孢镰刀菌jsnl008-1接种在pda平板培养基上培养10天后用打孔器打孔制成菌饼，并将菌饼接种到预先分装、灭菌好的燕麦4g/l+葡萄糖20g/l+马铃薯120g/l+酵母粉5g/+ph6.4的液体培养基中，在摇床上(160r/min，30℃)震荡培养16天，待真菌充分发酵后，用搅拌机将发酵液和菌丝球粉碎成均一的混合液，并在121℃下灭菌20min，冷却后置4℃冰箱中保存备用。
(2)按照如下组份进行种苗快繁培养基的配置：将步骤(1)中的真菌诱导子100ml/l+n6基础培养基+花宝3号20g/l+25g/l蔗糖+6g/l琼脂+20g/l土豆+80g/l香蕉，ph5.8，在121℃下灭菌20min备用。土豆和香蕉是去皮后用料理机粉碎成泥状加入。
(3)紫皮石斛种子播种进行种子萌发和种苗繁育：将紫皮石斛蒴果依次用70％酒精、0.1％升汞、无菌水进行消毒处理，在无菌条件下切开蒴果取出紫皮石斛种子，将种子均匀播撒在步骤(2)的培养基中，在温度23℃、光照1200lx、光照时间8h/d的培养室内培养60天后，待种子萌发成2cm高的小苗后，将温度调整为28℃、光照调整为2200lx、光照时间调整为14h/d培养120天即得可移栽的成品组培苗。
实施例5
一种利用真菌诱导子进行紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法，紫皮石斛种子萌发繁育种苗培养基中，花宝3号调整为5g/l，其他同实施例4。
实施例6
一种利用真菌诱导子进行紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法，紫皮石斛种子萌发繁育种苗培养基中，花宝3号调整为0g/l，其他同实施例4。
对比例2
一种利用真菌诱导子进行紫皮石斛种子萌发繁育种苗的方法，紫皮石斛种子萌发繁育种苗培养基中，花宝3号调整为0g/l，真菌诱导子浓度调整为0ml/l，其他同实施例4。
结果检测：
种子播种180天后，测定实施例4、5、6和对比例2的种苗直径种苗、平均株高及叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量。结果见表2。
表2
从表2可知，由尖孢镰刀菌jsnl008-1制备而成的真菌诱导子添加到紫皮石斛种子萌发繁育种苗的培养基中，能显著促进紫皮石斛种子萌发和生长；另外，不同的花宝3号浓度对紫皮石斛种子萌发生长也具有显著影响，实施例6在不添加花宝3号的情况下，其种苗直径、高度及叶绿素含量显著低于实施例4和实施例5。