一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因工程改造的嵌合抗原受体γδt细胞的制备方法。

背景技术：

t细胞根据细胞表面t细胞受体(tcellreceptor，tcr)分子结构的不同可以分为αβt细胞和γδt细胞。αβt细胞是适应性免疫细胞，对抗原的识别受主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)的限制，且需要抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，apc)的参与。由于肿瘤细胞往往存在mhc类分子丢失，因此αβt细胞无法有效清除肿瘤细胞，这大大降低了以αβt细胞为主导的抗肿瘤细胞免疫。利用基因工程技术对αβt细胞进行改造，使其表达嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)，从而制备出不受mhc和apc限制的αβt细胞，即car-t细胞技术。car-t细胞技术已经在血液系统肿瘤中取得了巨大的突破，以cd19为靶点的car-t细胞已于2017年被美国fda批准用于治疗儿童和年轻成年急性淋巴细胞性白血病患者。

γδt细胞虽然也是t细胞，但是却是固有免疫细胞，对抗原的识别不受mhc限制，也不需要apc的提呈。虽然γδt细胞在外周血t淋巴细胞中的比例仅为5％左右，但它却广泛参与过敏、感染、自身免疫病和肿瘤等疾病过程，是人体免疫系统第一道防线的重要组成部分。临床研究表明过继γδt细胞输注能够明显改善患者的生存质量。但是γδt细胞对肿瘤的杀伤不具有靶向性，如果能够提高γδt细胞对肿瘤细胞的靶向性杀伤，则必将进一步提高γδt细胞的临床应用价值。已有研究提出将car-t技术应用到γδt细胞上，能够提高γδt细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。但是由于γδt细胞在外周血中比例较低，因此从外周血中获得足量的γδt细胞，并用于car-γδt细胞的制备不仅操作复杂、成本高，而且需要抽取患者大量的外周血，给患者带来痛苦。虽然目前人们可以通过体外诱导扩增技术获得大量的γδt细胞，但是我们发现在γδt细胞扩增初期，如果按照car-t细胞的制备方案加入病毒，不仅不能获得car-γδt细胞，而且连γδt细胞都难于获得。这表明car-t细胞的制备方案并不适用于制备car-γδt细胞。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术中γδt细胞对某些肿瘤细胞的靶向性杀伤作用弱的问题，提供一种简单、快速、低成本制备嵌合抗原受体γδt细胞(car-γδt)的制备方法，以提高γδt细胞的特异性抗肿瘤作用。

技术方案

一种嵌合抗原受体γδt细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离，得到外周血单个核细胞(pbmcs)；

(2)向无血清培养基加入5-10v％的自体血浆，然后加入唑来膦酸、il-2和il-15，得到γδt细胞刺激培养基，使用γδt细胞刺激培养基悬起pbmcs，并调整密度至2-4×10⁶个细胞/ml，接种于培养瓶中，置于37℃、5％co2的培养箱中培养；

(3)待步骤(2)中培养至第3d时，离心去除刺激培养基，使用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调整到2-4×10⁶个细胞/ml，以后每2-3d根据细胞密度补充扩增培养基，使细胞密度维持在2-4×10⁶个细胞/ml，每天检测γδt细胞纯度，当γδt细胞纯度大于80％时，即可收获γδt细胞；

所述γδt细胞扩增培养基的制备方法：向无血清培养基中加入il-2和il-15，混匀即得；

(4)将步骤(3)得到的γδt细胞用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调至3-10×10⁶个细胞/ml，然后加入car病毒和polybrene进行感染，并置于37℃、5％co2的培养箱中培养；

(5)待步骤(4)中感染3-8h后，去除培养基以去除病毒，然后加入γδt细胞扩增培养基继续培养，每2-3d补加γδt细胞扩增培养基使细胞密度维持在2-4×10⁶个细胞/ml，每天检测改造后的γδt细胞比例，当比例大于10％时，收集的细胞即为嵌合抗原受体γδt细胞。

步骤(2)和(3)中，所述无血清培养基为本领域常规的无血清培养基，市售即可，比如x-vivo15^tm，optimizer的无血清t细胞培养基。

进一步，步骤(2)中，所述γδt细胞刺激培养基中，唑来膦酸浓度为1～50μm，il-2浓度为200-1000iu/ml，il-15浓度为5-50ng/ml。

进一步，步骤(3)中，所述无血清培养基中加有5-10v％的自体血浆，有利于细胞的扩增、生长。

进一步，步骤(3)中，所述γδt细胞扩增培养基中，il-2浓度为200-1000iu/ml，il-15浓度为5-50ng/ml。

进一步，步骤(3)中，γδt细胞的纯度检测方法采用的是流式细胞术。

进一步，步骤(4)中，所述car病毒的moi为10-20。moi的大小与最终阳性感染效率和细胞的活率都有关。moi过大，细胞感染效率可能会高，但是细胞死亡的数目较多。

进一步，步骤(4)中，polybrene的终浓度为2-10μg/ml。

进一步，步骤(5)中，去除培养基的方法是采用离心，离心速率为200-300×g，时间为5-10min。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种新型制备基因工程改造的car-γδt细胞的方法，与现有技术中制备car-t细胞相比，本发明去除了磁珠纯化过程，不仅降低了成本，而且操作更加简单，只需要少量患者外周血，就能制备出大量具有靶向杀伤作用的car-γδt细胞，有利于产业化生产car-γδt细胞。

附图说明

图1是实施例1中培养第9d时的γδt细胞的纯度结果；

图2是实施例1中培养第14d时的car-γδt细胞的流式结果；

图3是实施例1方法获得的car-γδt细胞的对肿瘤细胞的杀伤结果；

图4是实施例2方法培养第9d时的γδt细胞的纯度结果；

图5是实施例2中培养第14d时的car-γδt细胞的流式结果；

图6是实施例2方法获得的car-γδt细胞的对肿瘤细胞的杀伤结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

下述实施例中，所采用的无血清培养基为vivo-15^tm无血清培养基，购自lonza，唑来膦酸购自吉林省西点药业，il-2和il-15购自美天旎。

实施例1以cd19car病毒为例

一种嵌合抗原受体γδt细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备pbmcs；

a.采用肝素钠或肝素锂抗凝的真空采血管抽取50ml患者的外周血，在生物安全柜中，用一次性50ml无菌注射器将外周血转移至一次性50ml无菌离心管中，2000×g室温离心10min，将血浆转移至新的一次性50ml无菌离心管中，并于56℃的培养箱中放置30min以灭活补体；

b.在离心后的细胞沉淀中加入30-40ml的生理盐水或pbs，混合均匀。将稀释好的血细胞平均加入到2支含有15-20ml淋巴细胞分离液的淋巴细胞分离管中；

c.将离心机的升速设置为最大，降速度设置为最小，然后将上述装有淋巴细胞分离液和细胞的离心管轻轻放置于离心机的水平吊篮中，820×g室温离心25min；

d.离心结束后，轻轻取出离心管，并在生物安全柜中轻轻取出离心管中间的白膜层细胞至新的50ml无菌离心管中，使用10倍体积的生理盐水或pbs悬起细胞悬液，充分混匀，以400-500×g室温离心8min。离心结束后，弃掉上清，再加入生理盐水或pbs悬起细胞，以200-300×g室温离心8min，最终获得的细胞就是外周血单个核细胞(pbmcs)。

(2)向无血清培养基加入5v％的自体血浆，然后加入唑来膦酸、il-2和il-15，得到γδt细胞刺激培养基(γδt细胞刺激培养基中，唑来膦酸浓度为5μm，il-2浓度为500iu/ml，il-15浓度为10ng/ml)，使用γδt细胞刺激培养基悬起pbmcs，调整密度至3×10⁶个细胞/ml，接种于培养瓶中，并置于37℃、5％co2的培养箱中培养；

(3)待步骤(2)中培养至第3d时，离心去除刺激培养基，使用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调整到3×10⁶个细胞/ml，以后每2d根据细胞密度补充扩增培养基，使细胞密度维持在3×10⁶个细胞/ml，每天检测γδt细胞纯度，当γδt细胞纯度大于80％时，即可收获γδt细胞；图1是实施例1中培养第9d时的γδt细胞的纯度结果；从图1可以看出本方法可以获得高纯度的γδt细胞，比例为92.91％；

所述γδt细胞扩增培养基的制备方法：向无血清培养基中加入5v％的自体血浆、il-2和il-15，混匀即得；所述γδt细胞扩增培养基中，含有500iu/ml的il-2和10ng/ml的il-15。

(4)将步骤(3)得到的γδt细胞用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调至5×10⁶个细胞/ml，加入6孔板中，1ml/孔，加入cd19car-t病毒(病毒滴度为1×10⁹tu/ml，moi＝10)50μl和polybrene(终浓度8μg/ml)，进行感染，并置于37℃、5％co2的培养箱中培养；

(5)待步骤(4)中感染4h后，离心(200-300×g，5min)去除培养基以去除病毒，得到改造后的γδt细胞，加入新的γδt细胞扩增培养基继续培养，每2d补加γδt细胞扩增培养基使细胞密度维持在3×10⁶个细胞/ml，每天采用流式细胞术检测cd19car-γδt细胞比例，培养第14d时的car-γδt细胞的流式结果见图2，由图2可以看出，经本方法能够获得表达cd19-car的γδt细胞，比例为35.88％。

对比例1载体病毒对照组

步骤(1)-(3)以及步骤(5)与实施例1相同，步骤(4)中改为：将步骤(3)得到的γδt细胞用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调至5×10⁶个细胞/ml，加入6孔板中，1ml/孔，每孔加入对照病毒(病毒滴度为1×10⁹tu/ml，moi＝10)50μl和polybrene(终浓度8μg/ml)。对照病毒是空载体的对照病毒。cd19car病毒是将抗cd19的car基因连到载体中，然后制备成慢病毒。对照病毒就是不连接cd19car基因的载体制备的病毒。

对比例2γδt细胞组

步骤(1)-(3)以及步骤(5)与实施例1相同，步骤(4)中改为：将步骤(3)得到的γδt细胞用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调至5×10⁶个细胞/ml，加入6孔板中，1ml/孔，每孔加入50μl培养基和polybrene(终浓度8μg/ml)。

将实施例1制得的cd19car-γδt细胞进行感染效率和抗肿瘤功能检测，并与对比例1和对比例2的γδt细胞进行对比。测试方法如下：

(1)靶细胞的处理

1)分别收集培养的k562细胞和raji细胞作为靶细胞，以250×g室温离心5min，生理盐水或pbs洗1次；

2)用生理盐水或pbs重悬靶细胞，并将其密度调整至1×10⁶个细胞/ml；

3)取1ml靶细胞(1×10⁶个细胞/ml)，加入calceinam(终浓度为1μm)，37℃，5％co2培养箱中避光孵育25min。

4)孵育好的靶细胞用生理盐水或pbs洗2次，250×g室温离心5min，用含有5％fbs的rpmi-1640培养基重悬靶细胞，并将其密度调整至5×10⁴个细胞/ml，备用。

(2)效应细胞的处理

取cd19car-γδt细胞，以250×g室温离心5min，收集细胞，并用含有5％fbs的rpmi-1640培养基将细胞密度调整至5×10⁵个细胞/ml(10:1)。

(3)铺板

板子采用圆底无菌带盖96孔板，按照下表加入靶细胞和效应细胞，各设三个复孔，取平均值。

(4)孵育

放置在37℃、5％co2培养箱中避光孵育4h。

(5)检测

轻轻取出96孔培养板，注意不要使细胞悬起，如果细胞悬起，可250×g室温离心5min。从每孔中轻轻吸取上清100μl，转移至新的平底96孔平板中，吸取液体过程中不要触及板底细胞。在酶标仪检测上清荧光值(激发光波长485nm，发射光波长528nm)，根据下面公式计算细胞毒性：

细胞毒性(％)＝((实验孔-最小释放孔))/((最大释放孔-最小释放孔))×100％

图3是实施例1方法获得的cd19car-γδt细胞的特异性抗肿瘤活性的检测结果，由图3可以看出获得的cd19car-γδt对表达cd19的raji细胞的杀伤活性明显高于对比例1(载体病毒对照组)和对比例2(γδt细胞组)，而三组γδt细胞对k562细胞的杀伤作用未见明显差异，说明采用本方法获得的cd19car-γδt细胞能够明显提高γδt细胞对表达cd19肿瘤细胞的特异性杀伤作用。

实施例2以bcmacar病毒为例

一种嵌合抗原受体γδt细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)-(3)以及步骤(5)与实施例1相同，步骤(4)中改为：将步骤(3)得到的γδt细胞用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调至5×10⁶个细胞/ml，加入6孔板中，1ml/孔，每孔加入bcmacar-t病毒(病毒滴度为2×10⁹tu/ml，moi＝10)25μl和polybrene(终浓度8μg/ml)。图4是实施例2方法培养第9d时的γδt细胞的流式结果，从图4可以看出本方法可以获得高纯度的γδt细胞，比例为95.86％；图5是实施例2方法培养第14d时获得的car-γδt细胞的流式结果，由图5可以看出，经本方法能够获得表达bcmacar-γδt细胞，比例为22.91％。

对比例3载体病毒对照组

步骤(1)-(3)以及步骤(5)与实施例1相同，步骤(4)中改为：将步骤(3)得到的γδt细胞用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调至5×10⁶个细胞/ml，加入6孔板中，1ml/孔，每孔加入对照病毒(病毒滴度为1×10⁹tu/ml，moi＝10)50μl和polybrene(终浓度8μg/ml)。

对比例4γδt细胞组

步骤(1)-(3)以及步骤(5)与实施例1相同，步骤(4)中改为：将步骤(3)得到的γδt细胞用γδt细胞扩增培养基将细胞密度调至5×10⁶个细胞/ml，加入6孔板中，1ml/孔，每孔加入50μl培养基和polybrene(终浓度8μg/ml)。

将实施例2制得的bcmacar-γδt细胞进行感染效率和抗肿瘤功能检测，并与对比例3和对比例4的γδt细胞进行对比。测试方法与对比例2中测试方法相同，测试结果见图6。

图6是实施例2方法获得的car-γδt细胞的特异性抗肿瘤活性的检测结果，由图6可以看出获得的bcmacar-γδt对表达bcma的mm1s细胞的杀伤活性明显高于对比例3(载体病毒对照组)和对比例4(γδt细胞组)，而三组γδt细胞对k562细胞的杀伤作用未见明显差异，说明采用本方法获得的bcmacar-γδt细胞能够明显提高γδt细胞对表达bcma肿瘤细胞的特异性杀伤作用。