细胞株及其应用、B细胞的培养体系及培养方法和抗体的制备方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是涉及一种细胞株及其应用、b细胞的培养体系及培养方法和抗体的制备方法。
背景技术：
：cd40l，是cd40的配体，又称cd154，主要表达在活化的cd4+t细胞表面，属于tnf家族的蛋白分子。cd40l与抗原递呈细胞表达的cd40结合后，可参与多种信号通路，介导免疫细胞的生物学反应。cd40与cd40l结合后，可激发traf2，traf3和traf6信号，并启动nf-kb，jnk，p38等信号，介导细胞的增殖，凋亡等生物学活性。b细胞表面的cd40与活化t细胞表面的cd40l结合后，会引起b细胞的活化，同时会促进t细胞分泌细胞因子il-4，在这种刺激活化下，b细胞开始迅速分裂，并形成一个生发中心。在生发中心内，免疫球蛋白开始ig类别转换、亲和力成熟，b细胞也分化成终端浆细胞和记忆b细胞。因此，在b细胞分泌抗体的生物活动中，cd40-cd40l的信号发挥着重要的作用。研究表明，在cd40或cd40l缺失的小鼠模型中，小鼠的ig类别转换和生发中心的形成都显著降低，而且免疫应答也被严重抑制。cd40与cd40l的相互作用如图1所示。cd40分子与cd40l分子的相互作用在抗体类别转换和抗体产生中起重要作用，可用来诱导促进b细胞抗体分泌，产生单克隆抗体，用于科研、诊断和药物研发。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供保藏号为cctccno：c2018180的细胞株，所述细胞株为稳定表达兔源cd40l的rk-13细胞株。本发明的第二目的在于提供上述细胞株的应用。本发明的第三目的在于提供一种培养b细胞的培养体系，该培养体系包含上述细胞株。本发明的第四目的在于提供一种b细胞的培养方法。本发明的第五目的在于提供一种抗体的制备方法。为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：本发明提供了一种细胞株，细胞株的保藏号为cctccno：c2018180。本发明提供了上述细胞株的应用，包含如下(x1)-(x7)中的至少一种：(x1)制备饲养细胞；(x2)培养b细胞；(x3)制备抗体；(x4)构建兔源免疫模型；(x5)作为筛选抗兔cd40l抗体的筛选细胞；(x6)噬菌体库；(x7)高通量测序。本发明提供了一种用于培养b细胞的培养体系，该培养体系包含上述细胞株。优选地，所述培养体系还包括白细胞介素；优选地，所述白细胞介素包括il-4、il-10和il-21中的至少一种；优选地，所述il-4的终浓度为10-25ng/ml；优选地，所述il-10的终浓度为5-20ng/ml；优选地，所述il-21的终浓度为5-20ng/ml。优选地，所述培养体系还包括丝裂原；优选地，所述丝裂原包括脂多糖、美洲商陆丝裂原和葡萄酒菌蛋白a中的一种或多种；优选包括美洲商陆丝裂原；优选地，述美洲商陆丝裂原的终浓度为5-10μg/ml；优选为5.5-9μg/ml；更优选为6-8μg/ml。本发明提供了一种b细胞的培养方法，包括：使用上述细胞株与b细胞共培养，或使用上述培养体系培养b细胞。优选地，所述b细胞为兔源b细胞；优选为兔外周血b细胞。本发明提供了一种抗体的制备方法，包括使用上述b细胞的培养方法培养表达抗体的b细胞。优选地，使用抗原体外免疫兔外周血b细胞，得到表达抗体的兔外周血b细胞，再使用所述培养体系培养。优选地，包括如下步骤：将分离出的兔外周血淋巴细胞在包被有特异性抗原的培养容器中孵育；孵育完毕后消化贴壁细胞，得到抗原特异性的b细胞；重悬后置于含有所述培养体系的培养容器内进行体外培养。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的细胞株保藏号为cctccno：c2018180，可稳定的表达兔源cd40l，进一步的可应用于制备饲养细胞，培养b细胞，制备抗体，构建兔源免疫模型，作为筛选抗兔cd40l抗体的筛选细胞，噬菌体库，和/或高通量测序。本发明还提供了一种用于培养b细胞的培养体系，该培养体系包含上述细胞株，在体外为培养体系中稳定且持续的提供cd40l分子。cd40l和cd40结合后，可以促进b细胞的生产增殖，是b细胞体外存活，且进行抗体类型转换的重要因子，同时能促进记忆b细胞的发育。本发明还提供了一种抗体的制备方法，包括使用上述b细胞的培养方法培养表达抗体的b细胞。该方法无需制备杂交瘤细胞，操作简单。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为cd40与cd40l的相互作用的示意图；图2为本发明实施例1提供的转染后的饲养细胞表达的cd40l分子的sds-page结果；图3为本发明实施例1提供的转染后的饲养细胞中cd40l分子的pcr结果；图4为本发明实施例1提供的加压筛选后的饲养细胞中cd40l分子的sds-page结果；图5为本发明实施例1提供的加压筛选后的饲养细胞中cd40l分子的pcr结果；图6-a为本发明效果例2中待检测细胞的状态图；图6-b为本发明效果例2中对照孔中facs检测结果的直方图；图6-c为本发明效果例2中elisa阳性，facs检测为阴性的细胞的直方图；图6-d为本发明效果例2中elisa检测和facs检测均为阳性结果的直方图。具体实施方式下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明提供了一种稳定表达兔源cd40l的rk-13细胞株，该细胞株为兔肾细胞rk-13/cd40l，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctccno：c2018180，保藏单位地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学，保藏日期：2018年8月22日。rk-13细胞，是兔源的肾脏细胞，属于表皮细胞，贴壁生长，可以作为转染宿主进行外源基因的表达。该细胞本身高表达角蛋白，且无其他特异性表面蛋白表达，因此该细胞可以用于转染外源兔cd40l基因，并进行稳定表达筛选，最后获得稳定细胞株，该细胞株可以稳定的表达具有如seqidno.1所示核苷酸序列编码的兔源cd40l分子，本发明使用分子克隆技术和细胞培养技术，构建了能稳定表达兔cd40l分子的rk-13细胞，具有广泛的应用。该细胞在体外能诱导促进兔外周血b细胞分泌特异性抗体，并用于b细胞后期的研发和生产，如重组克隆，噬菌体库的建立，高通量测序等。本细胞作为饲养细胞，可以促进兔外周血b细胞分泌抗体。该细胞还可用于基于兔子的免疫反应实验。本发明还提供了上述细胞株的应用，包含如下(x1)-(x7)中的至少一种：(x1)制备饲养细胞；(x2)培养b细胞；(x3)制备抗体；(x4)构建兔源免疫模型；(x5)作为筛选抗兔cd40l抗体的筛选细胞；(x6)噬菌体库；(x7)高通量测序。在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。本发明提供的细胞株可以作为饲养细胞以培养待培养细胞。由于本发明提供的细胞株还可以稳定的表达作为cd40的配体的cd40l分子，因此该细胞株优选培养表面表达cd40的分子，例如可以为但不限于为b细胞；由于本发明细胞株表达的cd40l为兔源分子，因此本发明提供的细胞株优选作为兔源b细胞的饲养细胞。使用该细胞株与能够表达抗体的b细胞共培养，或者作为饲养细胞培养能够表达抗体的b细胞，在本发明提供的细胞株持续的提供b细胞共刺激分子cd40l的条件下，可以促进b细胞增殖并产生抗体。本发明提供的细胞株还可以构建兔源免疫模型，例如可以为但不限于为将该细胞株作为cd40l信号的提供者，参与cd40-cd40l信号通路的研究，或将稳定细胞株与兔b细胞进行反应，以研究traf通路，以进一步的用于与cd40分子或cd40l分子相关信号通路，或b细胞信号通路相关的药物的制备。由于该细胞株稳定表达cd40l分子，因此可以持续且稳定的提供cd40l分子作为抗原，以作为筛选抗兔cd40l抗体的筛选细胞。(x6)噬菌体库；抗体的噬菌体展示技术是以外源抗体基因(鼠源或兔源单克隆抗体等)转入到噬菌体内，通过噬菌体的外源表达，将抗体表达在菌体表面，利用重组蛋白或合成多肽进行筛选鉴定，最后获得目的抗体的技术。目前常用的噬菌体宿主为m13。对于外源基因的来源，更多的是采用免疫后的动物b细胞作为抗体噬菌体库，作为噬菌体进行表达的外源基因。因此，噬菌体库的质量优劣和容量的大小，直接影响到后续抗体的筛选。利用诱导刺激的b细胞作为建库细胞，直接产生特异性更专一的抗体序列，从而提高库的质量。(x7)高通量测序：高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(ngs，nextgenerationsequencing)。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。主要实验步骤包括1.样本准备，2.文库构建，3.测序，4.数据分析。通过饲养细胞和培养体系对兔的b细胞进行刺激，从而使高通量测序和数据分析的目的性更强。本发明还提供了一种用于培养b细胞的培养体系，该培养体系包含上述细胞株，能够在体外为培养体系中稳定且持续的提供cd40l分子，cd40l和cd40结合后，可以促进b细胞的生产增殖，是b细胞体外存活，且进行抗体类型转换的重要因子，同时能促进记忆b细胞的发育。在一些可选的实施方式中，所述培养体系还包括白细胞介素。白细胞介素interleukin缩写为il，是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，功能关系免疫反应的表达和调节，由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，因此被称为白细胞介素。添加白细胞介素可以增加b细胞在体外生长、增殖和分泌抗体的能力。在一些可选的实施方式中，所述白细胞介素包括il-4、il-10和il-21中的至少一种。白细胞介素4(interleukin-4，il-4)主要由抗原或丝裂原刺激的cd4+产生，属于红细胞生成素受体超家族成员。il-4是ii型辅助t细胞(th2细胞)分泌的细胞因子。il-4的生物作用，包括刺激活化b细胞和t细胞增殖、cd4+t细胞分化成ii型辅助t细胞，b细胞分化成浆细胞的主要因子，同时它也在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。可选地，所述il-4的终浓度为10-25ng/ml，例如可以为但不限于为10ng/ml、12ng/ml、15ng/ml、18ng/ml、20ng/ml、22ng/ml或25ng/ml；优选为15-25ng/ml；更优选为20ng/ml。白细胞介素10(interleukin-10，il-10)是一种同源二聚体细胞因子，是受体ⅱ型(ifn)受体家族中的一员，il-10由人和鼠的th0和th1的cd4+t细胞以及b细胞合成。il-10可抑制th1细胞和细胞毒性t细胞分泌il-2和ifn-γ，抑制中性粒细胞的吞噬活性。il-10可以诱导b细胞增殖分化。在b细胞存活、增殖中都有重要作用，还能促进抗体的产生。可选地，所述il-10的终浓度为5-20ng/ml，例如可以为但不限于为5ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、15ng/ml、18ng/ml或20ng/ml；优选为8-15ng/ml；更优选为10ng/ml。白细胞介素21(interleukin-21，il-21)是ⅰ型细胞因子γ链家族中的新型细胞因子，主要由活化的cd4+t细胞和自然杀伤t(nkt)细胞合成和分泌。il-21能够刺激t细胞和自然杀伤(nk)细胞增殖、调节b细胞和树突状细胞(dc)存活和分化功能而实现，从而参与机体的固有免疫和适应性免疫。il-21对b细胞的增殖，抗体的产生也发挥着重要作用。可选地，所述il-21的终浓度为5-20ng/ml；例如可以为但不限于为5ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、15ng/ml、18ng/ml或20ng/ml；优选为8-15ng/ml；更优选为10ng/ml。在一些可选的实施方式中，所述培养体系还包括丝裂原。丝裂原(mitogen)亦称有丝分裂原，可与淋巴细胞表面相应受体结合，刺激静止淋巴细胞转变为淋巴母细胞并进行有丝分裂，属于非特异性多克隆激活剂。t和b细胞表面表达多种丝裂原受体，在一些可选的实施方式中，所述丝裂原例如可以为但不限于为脂多糖、美洲商陆丝裂原和葡萄酒菌蛋白a中的一种或多种；优选包括美洲商陆丝裂原。美洲商陆丝裂原为从美洲商陆中提取的蛋白质，对t细胞和b细胞均可发挥致有丝分裂作用，可以促进b细胞的分化和增殖。可选地，所述美洲商陆的终浓度为5-10μg/ml，例如可以为但不限于为5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml或10μg/ml；优选为5.5-9μg/ml；更优选为6-8μg/ml。本发明还提供了一种b细胞的培养方法，包括：使用所述能够稳定表达兔源cd40l的rk-13细胞株与b细胞共培养，或使用上述培养体系培养b细胞。由于本发明提供的细胞株表达的是兔源cd40l分子，因此该b细胞的培养方法更适用于培养兔源的b细胞，更优选培养兔外周血b细胞。本发明还提供了一种抗体的制备方法，包括使用上述b细胞的培养方法培养表达抗体的b细胞。该方法无需制备杂交瘤细胞，操作简单。在一些可选的实施方式中，使用抗原体外免疫兔外周血b细胞，得到表达抗体的兔外周血b细胞，再使用所述培养体系培养。一方面，使用兔外周血b细胞制备兔源抗体，可以持续得到同一免疫兔子的外周血，进行不同次的重复，而且可以不处死兔子即可完成。另一方面，使用上述培养体系培养表达抗体的兔外周血b细胞可以持续的促进b细胞的增殖和分泌抗体，达到在体外持续产生抗体的目的。在一些优选的实施方式中，参考如下步骤制备抗体，制备效果更佳：(ⅰ)使用淋巴细胞分离液分离兔外周血细胞，将提取得到的兔外周血细胞重复用pbs离心洗2次，再用培养基离心洗1次，用12ml培养基重悬，均匀加入新的6孔板中，37℃培养箱中孵育1.5h；然后将上清中的细胞收集到50ml离心管内，重新加入新鲜培养基，1500rpm离心5min，细胞用培养基重悬，吹散，加培养基到10ml。(ⅱ)使用特异性抗原蛋白用pbs稀释至2μg/ml，6孔板2ml/孔，37℃包被2h，然后用2mlpbs洗3遍，再用培养基洗2遍；加入步骤(ⅰ)的细胞，2ml/孔，孵育1.5小时后弃去上清，用300μl胰酶消化贴壁细胞，消化后的细胞用培养基重悬，离心1500rpm，5分钟。用5ml培养基重悬，并进行细胞计数。(ⅲ)将分离的抗原特异性b细胞加到已有饲养细胞的细胞板内，向培养基中加入il-4，il-10，il-21，以及有丝分裂原pwm进行共同培养，8-10天后可进行elisa和/或facs检测。在上述步骤(ⅰ)中，由于单核细胞为贴壁细胞，t细胞和b细胞是悬浮细胞，所以先将分离出的淋巴细胞在培养基中孵育可以去除单核细胞，得到悬浮的t细胞和b细胞。在步骤(ⅱ)中，孔板是抗原处理过的，而b细胞表面有针对特异性抗原的抗体，因此可以与板子上的抗原相结合。所以，悬浮的细胞有t细胞和不能与特异性抗原相结合的b细胞，而孔板上留下的则是能与抗原结合的b细胞，即特异性b细胞。进而用胰酶消化贴壁细胞再进行重悬，可以去掉t细胞，只留下b细胞，以在培养的过程中进一步的分离出抗原特异性b细胞。下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。实施例1构建稳定表达兔cd40l蛋白的rk-13细胞本实施方案主要提供构建稳定表达兔cd40l蛋白的rk-13细胞。包括以下步骤：(ⅰ)制备包含兔cd40l基因的表达质粒，具体如下：(a)在nbci数据中查找兔cd40l基因信息，nm_001256781.1，序列如seqidno.1所示。(b)根据序列及表达载体的酶切位点，设计上下游引物：xhoi/mlui引物序列(5’-3’)酶切位点编号上游引物ccgctcgagatgatcgaaacgtacagccaacctaxhoiseqidno.2下游引物ccgaatgagtttgagacttgcgcagcmluiseqidno.3(c)以合成的基因为模板，用引物进行pcr，获取目的片段。(d)将目的片段进行双酶切，鉴定正确后，连接到pci-neo表达载体上，并将载体转化到e.coli内。(e)将质粒涂板，挑取单克隆，进行摇菌培养，并进行双酶切鉴定，鉴定正确后进行菌液扩大培养，质粒抽提，获得纯化后的质粒，用于转染。(ⅱ)测定rk-13对g418的敏感浓度。具体步骤如下：(a)用hepes配置100mg/mlg418用于稳定筛选使用，-20℃贮存。(b)收集rk-13细胞，并计数。(c)将rk-13细胞铺到96孔细胞培养板内，每孔1000个细胞。(d)加入不同浓度的g418(1000μg，800μg，600μg，500μg，400μg，300μg，200μg)到细胞培养板内，放入co2培养箱进行培养。(e)5-10天后观察细胞的活率。实验发现，在500μg/ml的g418浓度下，rk-13细胞正好处于存活状态，而600μg/ml的浓度下，细胞则死亡。(ⅲ)将兔cd40l表达质粒转染到rk-13细胞内，并进行检测(a)用lipofectamine3000转染试剂将cd40l质粒转染到rk-13细胞。(b)培养3天后进行sds-page检测和pcr检测。(c)sds-page电泳结果如图2所示，转染后的rk-13-cd40l细胞在40kda附近有明显的蛋白条带，lipofectamine3000转染后，兔cd40l表达明显高于fectin组。pcr检测结果如图3所示，转染后，800bp附件有目的条带；其中，图2中，泳道1为marker；泳道2为rk-13细胞；泳道3-5为使用转染试剂fectin转染cd40l表达质粒后的细胞，三组重复试验；泳道6-8为使用转染试剂lipofectamine3000转染cd40l表达质粒的细胞，三组重复试验；图3中，泳道m为marker；泳道1-2为rk-13细胞；泳道3为使用转染试剂fectin转染cd40l表达质粒的细胞；泳道4-5为使用转染试剂lipofectamine3000转染cd40l表达质粒的细胞。(ⅳ)对rk-13-cd40l细胞进行稳定性筛选(a)将转染后的rk-13-cd40l细胞进行g418稳定加压筛选。隔天进行细胞计数和活率测定。(b)54天后细胞达到稳定状态，并进行sds-page和pcr检测，结果如图4和图5所示；其中，图4中泳道1为marker；泳道2-3为稳定表达cd40l的rk-13细胞；图5中泳道1为marker；泳道2为稳定表达cd40l的rk-13细胞；泳道13为rk-13细胞。(c)检测实验显示，兔cd40l基因已经稳定表达在rk-13细胞上。实施例2制备兔源单克隆抗体(ⅰ)制备饲养细胞，包括如下步骤：(a)弃饲养细胞上清，用10mlpbs冲洗干净后加胰酶2ml，37℃消化3min。(b)加培养基6ml终止反应，用移液管吹起细胞，移取至离心管，1400rpm，5min。(c)弃上清，用900μl全培养基重悬，加100μlmcc，37℃孵育2h。(d)用15mlpbs1500rpm离心5min，再重复洗2遍，之后用10ml完全培养基重悬，计数，铺板10000个/孔，100μl/孔。(ⅱ)获取外周血抗原特异性b细胞，包括如下步骤：(a)特异性抗原蛋白用pbs稀释至2μg/ml，6孔板2ml/孔，37℃包被2h。(b)兔血:pbs＝1:1比例混合于50ml离心管内，轻柔吹匀。(c)兔血稀释液:兔外周血分离液＝1:1比例。把分离液先加入50ml离心管，用移液管缓慢加入兔血稀释液，保持分层状态。(d)将分层的分离液和兔血混合液离心管，小心的放入离心机，1800rpm，室温离心30min。(e)离心后的兔血，上至下细胞分四层。第一层：为血浆层。第二层：为环状乳白色淋巴细胞层。第三层：为透明分离液层。第四层：为红细胞层。小心吸取第二层乳白色细胞转移至50ml离心管，加pbs15ml，1500rpm离心5min。(f)重复用pbs离心洗2次，再用培养基离心洗1次，用12ml培养基重悬，均匀加入新的6孔板中，37℃培养箱中孵育1.5h。(g)将(f)步骤的上清收集到50ml离心管内，重新加入新鲜培养基，1500rpm离心5min，细胞用培养基重悬，吹散，加培养基到10ml。(h)将包被抗原的6孔板吸弃上清，加含血清的培养基2ml/孔封闭，37℃孵育1h。(i)将封闭后的含抗原的6孔板用2mlpbs洗3遍，再用培养基洗2遍后，加入步骤(g)的细胞，2ml/孔，孵育1.5小时。(j)弃去步骤(i)的上清，用300μl胰酶消化贴壁细胞，消化后的细胞用培养基重悬，离心1500rpm，5分钟。用5ml培养基重悬，并进行细胞计数。(ⅲ)体外培养体系继续培养b细胞，包括如下步骤：(a)将分离的抗原特异性b细胞加到已有饲养细胞的细胞板内，进行培养。(b)向培养基中加入il-4，il-10，il-21，以及有丝分裂原pwm至目标终浓度，进行共同培养。8天后进行elisa和/或facs检测。效果例1对外周血b细胞体外培养的上清进行elisa检测。(a)将特异性抗原以1μg/ml浓度包被，4℃过夜，次日用1％bsa封闭酶标板。(b)弃去封闭液，拍干后加入50μl培养上清，37℃孵育1小时。(c)用tbst清洗酶标板，3次，拍干后加入抗兔igg-hrp二抗，50μl每孔，37℃孵育半小时。(d)用tbst清洗酶标板，3次，拍干后加入现配tmb显色液，50μl每孔，室温显色，待阳性孔显出蓝色后，用硫酸终止液进行终止显色反应。(e)用酶标仪od450nm进行读数，并记录阳性孔位置，用于流式筛选或其他检测，elisa实验结果如表2所示：效果例2对elisa阳性孔进行上清的facs检测。(a)收集高表达特异性抗原的细胞，并用pbs进行清洗2次。(b)细胞用1％bsa的pbs进行4℃封闭半小时。用pbs洗2次，1500rpm/5分钟。(c)加入50μlelisa阳性的上清到细胞内，4℃孵育1小时。(d)用pbs洗3次，1500rpm/5分钟。加入抗兔igg-alexa-488荧光二抗，4℃孵育半小时。(e)用pbs洗3次，1500rpm/5分钟。加入0.5mlpbs重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，结果如图6-a、图6-b、图6-c和图6-d所示：其中，图6-a是细胞的状态图，横坐标是fcs，纵坐标是ssc，2个指标表示细胞的大小和分散情况，图中圈起的区域内的细胞为主要检测对象；图6-b是对照孔细胞的直方图，图6-c是elisa阳性，facs检测为阴性的细胞的直方图，图6-d为elisa检测和facs检测均为阳性结果的直方图；其中图6-b、图6-c和图6-d中横坐标是fl1，是荧光通道，纵坐标是荧光强度；直方图，越靠近纵轴，说明值越低，阴性越高；越远离纵轴，说明值越大，阳性越高。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>杭州华安单抗生物技术有限公司<120>细胞株及其应用、b细胞的培养体系及培养方法和抗体的制备方法<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>786<212>dna<213>兔（leporidae）<400>1atgatcgaaacgtacagccaacctactcctcgttctgtggccactggaccatctgttagc60atgaaaatttttatgtatttacttactgtttttcttattacccagatgatagggtcagcg120ctttttgctgtatatcttcatagaaggttggacaagatagaagatgaaaggaatcttcat180gaggattttgtattcatgaaaacgatacagagatgcaacaaaggagaagggtccttatcc240ctactgaactgtaaggaaattagaagccagtttgaaggcttcgtcaaggatataatgcta300aacaaagaggagccgaagaaagaaataaattttgaaatgcaaaaaggtgatcaggatcct360caaattgcagcacatctcataagtgaggccagtagtaaatcatcatctgttctacagtgg420gctaaaaaaggatattacaccatgagcaacactttggtaactcttgaaaatggaaaacag480ctgaaagtgaaaagacaaggattctattatatctatgcccaagtcaccttctgttccaat540caggaaccttcaagtcaagctccatttatagccagcttatgcctgaagtcttctggtgga600tcagaacgaatcctactcagagcagcaaatgcccgcagttcctccaaaacttgtgagcag660caatccatccacttgggaggagtatttgaattgcaagcggatgcttcggtgtttgtgaat720gtgactgatgcaagccaagtgaaccacgggaccggtttcacatcatttggcttactcaaa780ctctga786<210>2<211>34<212>dna<213>人工序列<400>2ccgctcgagatgatcgaaacgtacagccaaccta34<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列<400>3ccgaatgagtttgagacttgcgcagc26当前第1页12