一种叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物及其制备方法和用途。

背景技术：

恶性肿瘤是危害人类生命健康的头号杀手。在帮助肿瘤患者延长生存期、改善生活质量等方面，靶向制剂备受研究者关注。靶向给药具有药物用量少、毒副作用低、药物的生物利用度高、便于控制给药速度和方式、治疗效果好等优点。但是肿瘤耐药严重影响临床治疗效果，而药物传递系统具有逆转耐药的作用，已有报道其能有效地杀死肿瘤。其中逆转耐药是通过药物传递系统靶向线粒体，并激活凋亡系统获得的，其中三苯基膦(tpp)具有较强的线粒体靶向性。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(peo-ppo-peo，ppp)是一种两亲性三嵌段共聚物,近年来它作为药物传输载体在生物医用材料等方面中被广泛地运用。ppp在选择性溶剂中能够自发组装而形成胶束，是一类优良的药物传输载体，具有增加多重耐药癌细胞对抗癌药物的敏感性等优点。而将tpp与ppp共价结合，可以构建成为一个被动靶向到肿瘤部位的共聚物载体。又因在肿瘤细胞表面普遍存在一些过渡表达的受体如叶酸受体(fr)等，用叶酸(fa)修饰共聚物载体后，合成fa-peo-ppo-peo-tpp这一主动靶向载体，通过受体-配体效应以发挥主动靶向肿瘤细胞、主动靶向线粒体，逆转耐药，杀伤肿瘤的作用。

tpp是最典型且应用最广泛的亲脂性阳离子，具有较强的线粒体靶向性，是一种可穿过线粒体膜的离域的亲脂性阳离子，具有很强的脂溶性。

叶酸(folicacid，fa)是人体所必需的一种b族维生素，它是真核细胞进行一碳化合物代谢和从头合成核苷酸的必需物质。在正常组织中，叶酸受体(fr)低表达或不表达；在卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、鼻咽癌等细胞膜表面，fr被发现过度表达。肿瘤细胞过表达叶酸受体以摄取足够的叶酸，所以叶酸可以作为识别肿瘤细胞的靶向分子。

普朗尼克是一种多功能药用辅料，由于疏水部分(ppo)和亲水部分(peo)的比例不一样，因此其水溶解性有所不同。同时ppp作为一种表面活性剂，富含亲水亲油基团，可以降低复合物毒性和提高对细胞的亲和性，并具有实现逆转耐药的功能。目前尽管修饰ppp而成聚合物载体研究报道较多，但用亲脂性阳离子tpp⁺修饰ppp形成聚合物作为药物载体未见报道；并且在此基础上再加上fa修饰制备成的双靶向药物递送载体则有较强的创新性。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物及其制备方法和用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物，其化学结构式如式(ⅰ)所示：

其中，x和y均为大于零的整数。

本发明所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物采用叶酸和三苯基膦共同修饰普朗尼克共聚物，为一种新的聚合物，构建成为一个被动靶向到肿瘤部位的共聚物载体；又因在肿瘤细胞表面普遍存在一些过渡表达的受体如叶酸受体等，再用叶酸修饰上述共聚物载体后，最终合成叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克这一主动靶向载体，成功构建了叶酸受体和线粒体双靶向的共聚物作为药物/治疗基因递送载体。叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物能够有效逆转耐药的靶向制剂。该所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物作为载体，可以包载抗肿瘤药物或者抗癌基因后，能够高效地靶向肿瘤细胞及其线粒体，增加化疗药对肿瘤细胞的毒性，降低其对正常组织的毒副作用，最终达到逆转耐药，治疗患者的目的。

优选地，x为10～1000之间的整数，y为10～1000之间的整数。

更优选地，x为10～500之间的整数，y为10～200之间的整数。

本发明的目的还在于提供一种所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)、在氮气保护下，将三苯基膦与6-溴己酸溶解在溶剂中，在室温下搅拌，冷凝回流14～18h，反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，得5-羧基戊基-三苯基溴化磷；

(2)、在氮气保护下，将5-羧基戊基-三苯基溴化磷溶于二甲基亚砜中，加入聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、n,n’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌18～30h，反应结束后，过滤，取滤液，滤液纯化，减压真空干燥，得ppp-tpp；

(3)、将ppp-tpp、叶酸、n,n’二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶溶解于二甲基亚砜中，在氮气保护下室温搅拌反应18～30h，即得所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物。

通过发明人反复试验摸索得出，采用上述方法能够制得叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物。

优选地，步骤(1)中，所述三苯基膦和6-溴己酸的摩尔之比为：三苯基膦：6-溴己酸＝1:1～1.2；步骤(2)中，所述5-羧基戊基-三苯基溴化磷、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物、n,n’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔之比为：5-羧基戊基-三苯基溴化磷：聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物：n,n’-二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶＝1:(0.09～0.11)：(0.55～0.65):(0.008～0.0095)。

优选地，步骤(3)中，所述ppp-tpp、叶酸、n,n’二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔之比为：ppp-tpp：叶酸：n,n’二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶＝1:(1.8～2.2):(1.8～2.2):(1.8～2.2)。

采用上述原料配比时，制得的叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物收率较高，超出这些参数范围，制备产物难以获得或者得率低。

步骤(2)中，过滤的目的是为了去除二环己基脲。

优选地，步骤(1)中，所述溶剂为乙腈。乙腈用量优选为5～10ml。

优选地，步骤(2)中，所述滤液纯化是使用1500～3500分子量透析袋纯化，纯化时间为18～30小时。

优选地，步骤(2)，所述减压真空干燥的真空条件是-0.05～-0.1mpa。

本发明的目的还在于提供一种抗肿瘤制剂，包含所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物，以及抗肿瘤药物或抗肿瘤基因。

本发明的目的还在于提供一种荷载阿霉素的纳米药物的制备方法，包括以下步骤：将所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物和阿霉素用乙醇溶解后，在温度为20～30℃下，转速为200～400r/min下，旋转蒸发4～6h，即得所述荷载阿霉素的纳米药物。

和普通方式给药相比，采用上述方法制得的荷载阿霉素的纳米药物能获得更好的肿瘤治疗的效果。

采用该制备方法制得的荷载阿霉素的纳米药物经malvern粒度分析仪测定粒径为80～100nm。

优选地，所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物和阿霉素的重量之比为：叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物：阿霉素＝15～50:1。采用上述配比时，能更好地发挥阿霉素的效果，治疗效果更佳。

优选地，所述旋转蒸发后还包括纯化步骤：透析纯化18～30h，过滤。过滤可以使用滤膜过滤，优选使用0.22μm的滤膜。

优选地，所述温度为25℃，转速为300r/min下，旋转蒸发5h。

本发明的目的还在于提供一种荷载阿霉素的纳米药物，采用所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法制备而成。

本发明的目的还在于提供所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物作为药物载体的用途。

本发明的目的还在于提供所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物作为靶向给药系统的载体的用途。

所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物可以作为药物载体制备成微球、纳米颗粒或者凝胶。作为载体应用时优选上述形式，但不局限于上述形式。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物，所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物，为一种能够克服耐药和靶向到肿瘤细胞表面的fa受体的新型靶向聚合物，作为药物载体使用，能达到提高治疗肿瘤疗效的目的。该载体包载抗肿瘤药物或者抗癌基因后能够高效地靶向肿瘤细胞及细胞线粒体中，降低抗肿瘤药物对正常组织的毒副作用，实现逆转耐药，延长患者的生存期的目的。本发明还提供了叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物的制备方法。本发明还提供了一种荷载阿霉素的纳米药物及其制备方法。本发明还提供了叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物的用途。

附图说明

图1为叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物的结构式；

图2为实施例1ppp-tpp的hnmr图和fa-ppp-tpp的hnmr图；其中，图2a为ppp-tpp的hnmr图；图2b为fa-ppp-tpp的hnmr图；

图3为实施例3荷载阿霉素的纳米药物的纳米胶束粒径检测图。

具体实施方式

叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物：fa-ppp-tpp

ppp一端修饰了tpp⁺的共聚物：ppp-tpp

聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物：ppp

三苯基膦：tpp⁺

叶酸：fa

二甲基亚砜：dmso

阿霉素：dox

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物，其化学结构式如式(ⅰ)所示：

其中，x为133，y为50。

本实施例所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物的制备方法包括以下步骤：

(1)、在氮气保护下，将5mmol三苯基膦与5.25mmol6-溴己酸溶解在5ml乙腈中，在室温下搅拌，冷凝回流16h，反应结束后，旋转蒸发除去乙腈，得结晶5-羧基戊基-三苯基溴化磷(cooh-tpp)；

(2)、在氮气保护下，将0.66mmol5-羧基戊基-三苯基溴化磷溶于3～6ml二甲基亚砜中，加入0.066mmolppp、0.4mmoln,n’-二环己基碳二亚胺和0.006mmol4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌24h，反应结束后，过滤去除二环己基脲，取滤液，滤液纯化使用3500分子量透析袋，纯化时间为24小时，-0.1mpa减压真空干燥，得ppp一端修饰了tpp⁺的共聚物(ppp-tpp)；

(3)、将0.01ppp-tpp与0.02mmol叶酸、0.02mmoln,n’二环己基碳二亚胺和0.02mmol4-二甲氨基吡啶溶解于3ml二甲基亚砜中，反应混合物在室温下使用磁搅拌器搅拌，在密闭条件下反应24h，滤液蒸馏水透析24h，减压干燥，即得所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物(fa-ppp-tpp)。

图2a中，1h-nmr(600mhz,dmso-d6),tpp:7.911(6hj),7.321(3hk)6.980(6hi)。ppp:3.670(8hb)，3.52(4hc)，2.48(2ha)，1.105(1hd)，1.72(2he)，1.65(2hi)，1.30(2hf)，1.25(4hg,h)，表明ppp-tpp合成成功。此中间体可以直接应用于下一步反应。

取步骤(3)的反应产物用dmso溶解后进行检测，与fa[280nm(强吸收)和350nm(弱吸收)]相比，测得其在278nm强吸收峰，紫移2个纳米；初步表明获得了fa-ppp-tpp。

图2b中，1h-nmr(600mhz,dmso-d6),fa：8.675(1h1),8.17(1h2),7.678(1h3)，6.98(1h4),6.668(1h5),4.514(1h6),4.359(1h7),2.344(1h8),2.077(1h9),1.939(1h10).tpp:7.911(6hj),7.321(3hk)6.980(6hl)。ppp:3.670(8hb)，3.52(4hc)，2.48(2ha)，1.105(1hd).表明fa-ppp-tpp合成成功。

一种采用本实施例所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法制备而成的荷载阿霉素的纳米药物。与游离的阿霉素或者未经叶酸修饰的ppp-tpp/dox相比，该纳米药物能有效逆转耐药细胞，杀死肿瘤细胞。

实施例2

本实施例所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物化学结构式如式(ⅰ)所示，其中，x为100，y为65，制备方法包括以下步骤：

(1)、在氮气保护下，将10mmol三苯基膦与10.5mmol6-溴己酸溶解在10ml乙腈中，在室温下搅拌，冷凝回流16h，反应结束后，旋转蒸发除去乙腈，得结晶5-羧基戊基-三苯基溴化磷(cooh-tpp)；

(2)、在氮气保护下，将1.32mmol5-羧基戊基-三苯基溴化磷溶于3～6ml二甲基亚砜中，加入0.132mmolppp、0.8mmoln,n’-二环己基碳二亚胺和0.012mmol4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌24h，反应结束后，过滤去除二环己基脲，取滤液，滤液纯化使用3500分子量透析袋，纯化时间为24小时，-0.1mpa减压真空干燥，得ppp一端修饰了tpp⁺的共聚物(ppp-tpp)；

(3)、将0.02ppp-tpp与0.04mmol叶酸、0.03mmoln,n’二环己基碳二亚胺和0.03mmol4-二甲氨基吡啶溶解于6ml二甲基亚砜中，反应混合物在室温下使用磁搅拌器搅拌，在密闭条件下反应24h，滤液蒸馏水透析24h，减压干燥，即得所述叶酸和三苯基膦共同修饰的普朗尼克共聚物(fa-ppp-tpp)。

通过hnmr图谱验证得，本实施例所述制备方法成功制得fa-ppp-tpp。

一种采用本实施例所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法制备而成的荷载阿霉素的纳米药物。与游离的阿霉素或者未经叶酸修饰的ppp-tpp/dox相比，该纳米药物能有效逆转耐药细胞，杀死肿瘤细胞。

实施例3

一种荷载阿霉素的纳米药物的制备方法的实施例，本实施例中，fa-ppp-tpp结构式如式(ⅰ)所示，其中x为80，y为20。本实施例所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法包括以下步骤：取10mgfa-ppp-tpp和0.67mg的dox于10ml西林瓶中，用适量乙醇溶解后，25℃、300r/min旋转蒸发5h将有机溶剂蒸干，用透析袋透析纯化24h后，用0.22μm滤膜过滤，即得荷载阿霉素的纳米药物(fa-ppp-tpp/dox)胶束溶液，经malvern粒度分析仪测定粒径在80～100nm(图3)。

通过hnmr图谱验证得，本实施例所述制备方法成功制得fa-ppp-tpp。

一种采用本实施例所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法制备而成的荷载阿霉素的纳米药物。与游离的阿霉素或者未经叶酸修饰的ppp-tpp/dox相比，该纳米药物能有效逆转耐药细胞，杀死肿瘤细胞。

实施例4

一种荷载阿霉素的纳米药物的制备方法的实施例，本实施例中，fa-ppp-tpp结构式如式(ⅰ)所示，其中x为17，y为12。本实施例所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法包括以下步骤：取20mgfa-ppp-tpp和1mg的dox于10ml西林瓶中，用适量乙醇溶解后，20℃、400r/min旋转蒸发5h将有机溶剂蒸干，用透析袋透析纯化18h后，用0.22μm滤膜过滤，即得荷载阿霉素的纳米药物(fa-ppp-tpp/dox)胶束溶液，经malvern粒度分析仪测定粒径在80～100nm。

通过hnmr图谱验证得，本实施例所述制备方法成功制得fa-ppp-tpp。

一种采用本实施例所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法制备而成的荷载阿霉素的纳米药物。与游离的阿霉素或者未经叶酸修饰的ppp-tpp/dox相比，该纳米药物能有效逆转耐药细胞，杀死肿瘤细胞。

实施例5

一种荷载阿霉素的纳米药物的制备方法的实施例，本实施例中，fa-ppp-tpp结构式如式(ⅰ)所示，其中x为133，y为10。本实施例所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法包括以下步骤：取20mgfa-ppp-tpp和0.4mg的dox于10ml西林瓶中，用适量乙醇溶解后，30℃、200r/min旋转蒸发6h将有机溶剂蒸干，用透析袋透析纯化30h后，用0.22μm滤膜过滤，即得荷载阿霉素的纳米药物(fa-ppp-tpp/dox)胶束溶液，经malvern粒度分析仪测定粒径在80～100nm。

通过hnmr图谱验证得，本实施例所述制备方法成功制得fa-ppp-tpp。

一种采用本实施例所述荷载阿霉素的纳米药物的制备方法制备而成的荷载阿霉素的纳米药物。与游离的阿霉素或者未经叶酸修饰的ppp-tpp/dox相比，该纳米药物能有效逆转耐药细胞，杀死肿瘤细胞。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。