本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基及其制备方法。
背景技术：
质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是dna重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞（如大肠杆菌）中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。细菌的培养作为生产质粒dna的第一步，在整个生产过程中起着关键的作用。它兴驻直接影响到质粒dna的产量，而且也影响下续步骤的进行。因此，选择和优化菌体的生长条件，是产生大量稳定的质粒dna必要条件，特别是培养基的组成成分和浓度对细菌的生长和质粒dna的含量有较大的影响。
现有的运用于质粒dna工程菌高密度表达的培养基虽然可以达到较高的菌体密度和质粒总量的目标，但质粒dna比含量普遍较低，利用现有的培养基配方，虽然质粒dna含量有了一定程度的提高，但结果仍不令人满意。为了有利于质粒dna的纯化，有必要开发出一种适用于工程菌高密度发酵培养且能显著提高质粒dna比含量的培养基。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基及其制备方法，其最终制备的培养基，有效的改善了常规lb培养基的配制，提高了单位培养基中的单位菌量，培养的大肠杆菌高效表达质粒dna，为基因工程的发展奠定很好的基础，极具市场推广价值。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基，由以下重量份组分组成：
牛肉膏2~4份、蛋白胨10~12份、氯化钠2~3份、改性碳酸镧3~4份、活性炭1~2份、酒石酸0.3~0.4份、柠檬酸0.1~0.2份、甘油12~14份、去离子水800~900份。
优选的，由以下重量份组分组成：
牛肉膏3份、蛋白胨11份、氯化钠2.5份、改性碳酸镧3.5份、活性炭1.5份、酒石酸0.35份、柠檬酸0.15份、甘油13份、去离子水850份。
进一步的，所述改性碳酸镧的制备方法包括如下步骤：
a.将碳酸镧投入质量分数为2~4%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时保持盐酸溶液中的温度为60~70℃，浸泡处理10~12min后滤出备用；
b.将步骤a中酸液浸泡处理后的碳酸镧投入质量分数为4~5%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时保持氢氧化钠溶液中的温度为90~100℃，浸泡处理17~19min后滤出备用；
c.将步骤b中氢氧化钠浸泡处理后的碳酸镧和改性液按照质量体积比为1g:30~40ml共同投入反应釜中，将反应釜中的压力控制为0.4~0.5mpa，反应釜内的温度控制为200~300℃，处理20~24min后过滤得滤渣；
d.将步骤c中所得的滤渣投入烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为70~80℃，干燥至含水率为2~5%即可。
进一步的，所述步骤c中改性液中各成分及对应重量份为：甘油20~26份、辛基酚聚氧乙烯醚3~5份、十四烷基三甲基溴化铵12~14份、十六烷基磺酸钠13~15份、去离子水400~500份。
一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基的制备方法，包括如下步骤：
（1）称取相应重量份的牛肉膏2~4份、蛋白胨10~12份、氯化钠2~3份、改性碳酸镧3~4份、活性炭1~2份、酒石酸0.3~0.4份、柠檬酸0.1~0.2份、甘油12~14份、去离子水800~900份备用；
（2）将步骤（1）中称取的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、改性碳酸镧、活性炭、酒石酸、柠檬酸、甘油、去离子水共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度控制为96~100℃，持续搅拌30~40min，在搅拌的同时进行射线辐照处理；
（3）等到步骤（2）中所得溶液内的温度降至40~50℃时，用1~2mol/l的盐酸溶液或1~2mol/l的氢氧化钠溶液将步骤（2）中所得的溶液的ph调至7.3~7.7。
进一步的，所述步骤（2）中射线辐照的形式为β射线，辐照的剂量为2~3gy/min。
本发明在现有的大肠杆菌培养基配方的基础上做了很大的改进，在配方中添加了改性碳酸镧，将碳酸镧先后经过酸液和碱液浸泡处理，软化碳酸镧表面，为后续的改性处理奠定基础，然后在高温高压的条件下进行改性处理，改性液中的甘油可以增加改性液的流动性，提高碳酸镧表面的活性，阳离子型十四烷基三甲基溴化铵和阴离子型十六烷基磺酸钠复配制成，用其作为改善修饰剂对碳酸镧表面进行改性处理，改善了碳酸镧表面的反应活性，以及与培养基中其他成分之间的相容性，改性后的碳酸镧添加到培养基中，有助于增强培养基中其他原料成分的凝结性，促进工程菌对有效成分的吸收，提高菌液的繁殖速度，改性碳酸镧表面具有巨大的分子网状结构，可以吸收工程菌的代谢废物，有效的防止细菌代谢物对其他活菌的毒害作用，使活菌可以高效表达。因为菌体的长期保存的过程中，难免会产生部分死菌和毒性代谢物，本发明添加的活性炭与改性碳酸镧配合使用，进一步改善培养基的品质，保证菌体的健康快速繁殖。申请人在大量的实验中发现在菌体培养基中添加酒石酸、柠檬酸等可以抑制革兰氏阳性菌的生长，增加培养基的选择性，保证了大肠杆菌的纯度，但是添加单一的某种酸对于提高大肠杆菌的纯度只有很小的改善作用，申请人在大量的实验中将酒石酸和柠檬酸合理搭配，配合使用对于提高大肠杆菌的纯度具有很好的改善作用，进而提高质粒dna的纯度，减少了质粒纯化的操作成本。在培养基的制备过程中，进行β射线辐照处理，β射线激发产生活化原子和活化分子，增加培养基的抗微生物能力，防止培养基遭受杂菌的侵染，射线辐照可以辅助培养基的制备，加快培养基中有效成分之间的交联、聚合，提高培养基营养的均衡性。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明最终制备的培养基，有效的改善了常规lb培养基的配制，提高了单位培养基中的单位菌量，培养的大肠杆菌高效表达质粒dna，为基因工程的发展奠定很好的基础，极具市场推广价值。
具体实施方式
实施例1
一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基，由以下重量份组分组成：
牛肉膏2份、蛋白胨10份、氯化钠2份、改性碳酸镧3份、活性炭1份、酒石酸0.3份、柠檬酸0.1份、甘油12份、去离子水800份。
进一步的，所述改性碳酸镧的制备方法包括如下步骤：
a.将碳酸镧投入质量分数为2%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时保持盐酸溶液中的温度为60℃，浸泡处理10min后滤出备用；
b.将步骤a中酸液浸泡处理后的碳酸镧投入质量分数为4%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时保持氢氧化钠溶液中的温度为90℃，浸泡处理17min后滤出备用；
c.将步骤b中氢氧化钠浸泡处理后的碳酸镧和改性液按照质量体积比为1g:30ml共同投入反应釜中，将反应釜中的压力控制为0.4mpa，反应釜内的温度控制为200℃，处理20min后过滤得滤渣；
d.将步骤c中所得的滤渣投入烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为70℃，干燥至含水率为2%即可。
进一步的，所述步骤c中改性液中各成分及对应重量份为：甘油20份、辛基酚聚氧乙烯醚3份、十四烷基三甲基溴化铵12份、十六烷基磺酸钠13份、去离子水400份。
一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基的制备方法，包括如下步骤：
（1）称取相应重量份的牛肉膏2份、蛋白胨10份、氯化钠2份、改性碳酸镧3份、活性炭1份、酒石酸0.3份、柠檬酸0.1份、甘油12份、去离子水800份备用；
（2）将步骤（1）中称取的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、改性碳酸镧、活性炭、酒石酸、柠檬酸、甘油、去离子水共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度控制为96℃，持续搅拌30min，在搅拌的同时进行射线辐照处理；
（3）等到步骤（2）中所得溶液内的温度降至40℃时，用1mol/l的盐酸溶液或1mol/l的氢氧化钠溶液将步骤（2）中所得的溶液的ph调至7.3。
进一步的，所述步骤（2）中射线辐照的形式为β射线，辐照的剂量为2gy/min。
实施例2
一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基，由以下重量份组分组成：
牛肉膏3份、蛋白胨11份、氯化钠2.5份、改性碳酸镧3.5份、活性炭1.5份、酒石酸0.35份、柠檬酸0.15份、甘油13份、去离子水850份。
进一步的，所述改性碳酸镧的制备方法包括如下步骤：
a.将碳酸镧投入质量分数为3%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时保持盐酸溶液中的温度为65℃，浸泡处理11min后滤出备用；
b.将步骤a中酸液浸泡处理后的碳酸镧投入质量分数为4.5%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时保持氢氧化钠溶液中的温度为95℃，浸泡处理18min后滤出备用；
c.将步骤b中氢氧化钠浸泡处理后的碳酸镧和改性液按照质量体积比为1g:35ml共同投入反应釜中，将反应釜中的压力控制为0.45mpa，反应釜内的温度控制为250℃，处理22min后过滤得滤渣；
d.将步骤c中所得的滤渣投入烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为75℃，干燥至含水率为3.5%即可。
进一步的，所述步骤c中改性液中各成分及对应重量份为：甘油23份、辛基酚聚氧乙烯醚4份、十四烷基三甲基溴化铵13份、十六烷基磺酸钠14份、去离子水450份。
一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基的制备方法，包括如下步骤：
（1）称取相应重量份的牛肉膏4份、蛋白胨11份、氯化钠2.5份、改性碳酸镧3.5份、活性炭1.5份、酒石酸0.35份、柠檬酸0.15份、甘油13份、去离子水850份备用；
（2）将步骤（1）中称取的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、改性碳酸镧、活性炭、酒石酸、柠檬酸、甘油、去离子水共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度控制为98℃，持续搅拌35min，在搅拌的同时进行射线辐照处理；
（3）等到步骤（2）中所得溶液内的温度降至45℃时，用1.5mol/l的盐酸溶液或1.5mol/l的氢氧化钠溶液将步骤（2）中所得的溶液的ph调至7.5。
进一步的，所述步骤（2）中射线辐照的形式为β射线，辐照的剂量为2.5gy/min。
实施例3
一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基，由以下重量份组分组成：
牛肉膏4份、蛋白胨12份、氯化钠3份、改性碳酸镧4份、活性炭2份、酒石酸0.4份、柠檬酸0.2份、甘油14份、去离子水900份。
进一步的，所述改性碳酸镧的制备方法包括如下步骤：
a.将碳酸镧投入质量分数为4%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时保持盐酸溶液中的温度为70℃，浸泡处理12min后滤出备用；
b.将步骤a中酸液浸泡处理后的碳酸镧投入质量分数为5%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时保持氢氧化钠溶液中的温度为100℃，浸泡处理19min后滤出备用；
c.将步骤b中氢氧化钠浸泡处理后的碳酸镧和改性液按照质量体积比为1g:40ml共同投入反应釜中，将反应釜中的压力控制为0.5mpa，反应釜内的温度控制为300℃，处理24min后过滤得滤渣；
d.将步骤c中所得的滤渣投入烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为80℃，干燥至含水率为5%即可。
进一步的，所述步骤c中改性液中各成分及对应重量份为：甘油26份、辛基酚聚氧乙烯醚5份、十四烷基三甲基溴化铵14份、十六烷基磺酸钠15份、去离子水500份。
一种大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基的制备方法，包括如下步骤：
（1）称取相应重量份的牛肉膏4份、蛋白胨12份、氯化钠3份、改性碳酸镧4份、活性炭2份、酒石酸0.4份、柠檬酸0.2份、甘油14份、去离子水900份备用；
（2）将步骤（1）中称取的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、改性碳酸镧、活性炭、酒石酸、柠檬酸、甘油、去离子水共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度控制为100℃，持续搅拌40min，在搅拌的同时进行射线辐照处理；
（3）等到步骤（2）中所得溶液内的温度降至50℃时，用2mol/l的盐酸溶液或2mol/l的氢氧化钠溶液将步骤（2）中所得的溶液的ph调至7.7。
进一步的，所述步骤（2）中射线辐照的形式为β射线，辐照的剂量为3gy/min。
对比实施例1
本对比实施例1与实施例2相比，省去改性碳酸镧，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例2
本对比实施例2与实施例2相比，省去活性炭，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例3
本对比实施例3与实施例2相比，省去酒石酸、柠檬酸，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例4
本对比实施例4与实施例2相比，在大肠杆菌高效表达质粒dna的培养基的制备方法中，省去步骤（2）中的射线辐照处理，除此外的方法步骤均相同。
对照组
申请号为：201610877655.6公开的用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒dna的培养基及培养方法。
为了对比本发明效果，选取大肠杆菌dh5α菌株作为实验对象，分别用实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对照组的方法制备培养基，然后分别取500μl大肠杆菌dh5α菌株接种于500ml对应制备的培养基中，然后置于摇床中进行摇菌培养，培养条件为摇床转速为200rpm，摇床内温度为32℃，当菌液od600大于0.9时，停止摇菌，取菌液以10000g离心速度、4℃、20min离心条件收获菌体，进行相关检测。
（3）质粒抽提，参数测定：
采用qiagen质粒小量抽提试剂盒按操作说明进行。质粒含量采用紫外分光光度计测定260nm波长的a值确定。质粒纯度的测定采用紫外分光光度计测定260nm、280nm波长的吸收比值确定（符合质量标准的比值应在1.75-1.85之间）。
具体实验对比数据如下表1所示：
表1
由上表1可以看出，本发明最终制备的培养基，有效的改善了常规lb培养基的配制，提高了单位培养基中的单位菌量，培养的大肠杆菌高效表达质粒dna，并且质粒纯度很高，为基因工程的发展奠定很好的基础，极具市场推广价值。