一种坛紫菜多糖及其制备方法与益生活性应用与流程

本发明属于保健食品领域，尤其涉及一种坛紫菜多糖及其制备方法与益生活性应用。

背景技术：

肠道菌群在人体健康中发挥着重要作用，是人体重要的“微生物器官”。已有研究表明，肠道菌群能够调节肠道运动和分泌,分解食物中的大分子复合多糖,参与营养物质的消化和吸收,维持肠上皮屏障的完整性,促进并维护免疫系统的正常发育和活动等。因此，肠道菌群调控着宿主正常生理功能及疾病的发展。目前，人们已经清楚地认识到，人体的生理代谢不仅受其自身基因的控制，还受肠道菌群的调控。膳食多糖是肠道菌群代谢的最主要的底物，能被肠道微生物分泌的碳水化合物活性酶降解产生低聚糖或单糖从而被肠道菌群进一步酵解产生短链脂肪酸等有益物质，调节肠道菌群的结构组成。因此，膳食多糖在肠道菌群调控代谢健康中的发挥着重要作用。lynch等人就表明膳食干预是菌群防治疾病的根本解决之道。

坛紫菜，属红藻门，红毛菜科，紫菜属植物，是我国大规模养殖的重要经济海藻之一，主要产于广东、福建、浙江等地。坛紫菜含有较多的蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质，具有很高的营养价值。《本草纲目》中就有记载坛紫菜具有清热利水、化痰软坚和补肾养心等功效。坛紫菜中含有大量的坛紫菜多糖，属于半乳聚硫酸酯，由1，3-β-d-半乳糖和1，4-α-l-3，6-内醚半乳糖交替连接的二糖重复单位组成，有时被β-d-半乳糖-6-甲氧基和α-l-半乳糖-6-硫酸基取代。现代研究表明，坛紫菜多糖具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗凝、降血糖、降血脂、抗流感病毒等多种生理活性，因此，坛紫菜多糖在功能性食品、药品以及化妆品领域有着巨大的应用潜力。然而，目前无论是采用传统的热水浸提法还是较为热门的微波辅助提取法得到的多糖溶解溶解性都很差，并且还粘度大，这些理化性质极大的限制了多糖的工业应用。另外，坛紫菜多糖作为一种重要的膳食多糖，其调节人体肠道菌群的功能活性尚未被报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种坛紫菜多糖及其制备方法与益生活性应用，以解决目前多糖的溶解性差、粘度大，工业应用受到极大的限制等问题。

为解决上述问题，本发明提供了一种坛紫菜多糖的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)原料处理：坛紫菜暴晒、粉碎机粉碎后，经有机混合溶液脱色，将不溶物干燥；

(2)提取：将步骤(1)中坛紫菜粉末不溶物利用热水浸提法进行提取，料液比1：30加水，提取温度90℃，提取时间2h；

(3)醇沉：将步骤(2)中提取产物趁热离心并收集上清液，向其中缓慢加入3倍体积95％的乙醇溶液，4℃静置过夜，离心收集多糖沉淀；

(4)复溶：将步骤(3)中获得的多糖沉淀复溶于盐溶液中，透析除去小分子化合物并获得坛紫菜多糖溶液，浓缩；

(5)真空干燥：在真空环境下对步骤(4)中所得的多糖溶液冷冻干燥，获得坛紫菜多糖。

本发明采用水提醇沉和复溶方法相结合，其中复溶是醇沉多糖溶解在低浓度盐溶液中而不是纯水中，除盐冻干之后的多糖的溶解性和粘度要被大大改善，使多糖更能被有效利用。

进一步的，步骤(4)所述盐溶液为nacl、nahco3、k2hpo4、kh2po4中的一种或几种，浓度为0.1mol/l。

进一步的，步骤(2)所述热水浸提之前于室温静置30min，在细胞膨胀状态下，细胞壁在提取过程中更容易破裂，多糖更易溶出。

进一步的，步骤(1)所述有机混合溶液为甲醇：二氯甲烷：水按照体积比4:2:1的混合溶液。

上述制备方法得到的坛紫菜多糖。本发明坛紫菜多糖由对细菌不太有利的外层和容易利用的内层组成，可以调节人体肠道菌群，提高免疫力。坛紫菜多糖的结构对其发酵特性具有一定的影响，具有延迟的发酵行为，因为不太有利的外层必须优先被降解，核心结构才能暴露出来供肠道益生菌生长和利用。

上述坛紫菜多糖在制备益生活性的药物和/或食品的应用。

进一步的，所述应用包含坛紫菜多糖对人体肠道菌群的组成、结构、多样性以及对scfas产量的影响。

进一步的，所述应用包含坛紫菜多糖对多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、普拉梭菌(faecalibacteriumprausnitzii)等肠道益生菌增殖的促进作用；对肠道菌群产生大量的短链脂肪酸(scfa)的促进作用；对致病菌生长的抑制作用。

一种包含上述坛紫菜多糖的多糖酸奶咀嚼片。本发明的多糖酸奶咀嚼片是益生元和益生菌的结合体，而且成本低。

上述多糖酸奶咀嚼片的制备方法，主要包括以下步骤：

(s1)原料调配：按重量百分比添加坛紫菜多糖5-10份、蔗糖5-10份、木糖醇6-8份、果胶0.2-0.5份充分混合均匀，牛乳加至100份；

(s2)预热和均质：将步骤(s1)的原料充分搅拌混匀，预热到50-60℃，然后转移至均质机中进行均质，均质压力为20-25mpa；

(s3)灭菌与冷却：在85-95℃下保持15-20min进行灭菌，随后冷却至40-45℃；

(s4)接种：将3-5份混合菌种发酵剂加入到步骤(s3)中冷却后的混合乳中，搅拌均匀使发酵剂均匀分布，迅速封口；

(s5)发酵：将接种后的混合乳在42℃条件下保温发酵4-6h，待完全凝乳后停止发酵，并立即在4℃的条件下冷却；

(s6)将发酵好的酸奶与下列重量份的辅料成分混合均匀：硬脂酸镁0.5-1份，丝胶肽1-2份；经过-20℃预冻至少12h后，真空冷冻干燥24h后取出，加入淀粉15-20份，混匀研磨成细粉状态；

(s7)将步骤(s6)所得酸奶粉在20kn的压力下压片成粒。

其中，所述混合菌种发酵剂包括乳酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌任选两种按照等质量比组配。

与现有技术相比，本发明以坛紫菜为原料经传统热水浸提法提取，通过乙醇沉淀后将获得的多糖沉淀复溶在低浓度盐溶液中，透析冻干后得到的溶解性和粘度被大大改善的坛紫菜多糖，更有利于发挥其调节人体肠道菌群的作用，表现为促进多形拟杆菌、卵形拟杆菌、普拉梭菌等多种肠道益生菌的增殖，而抑制致病菌的生长；同时，还促进肠道菌群产生大量的短链脂肪酸。坛紫菜多糖作为来源广泛的食用海藻的天然海藻多糖产物安全性高。将提取的坛紫菜多糖加入到酸奶中制成酸奶咀嚼片，得到的多糖酸奶咀嚼片集结益生元和益生菌两者功效于一身，对人体无任何副作用，更是具有调节人体肠道菌群功能、增强机体免疫力之功效，且便于携带，服用方便。

附图说明

图1是坛紫菜多糖在高效凝胶色谱图中的分子量分布图；

图2坛紫菜多糖对人体肠道菌群结构组成的影响；左：dgge图，#1、#2、#3、#4分别表示发酵0h、6h、12h、24h；右：系统发育树；

图3坛紫菜多糖的结构对发酵特性的影响，其中a、b、c、d分别表示发酵0h、6h、12h、24h；1、2分别表示图像放大倍数为300×和5000×。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：坛紫菜多糖php的制备

坛紫菜经暴晒、粉碎机粉碎后，按照料液比1:10称取干燥坛紫菜粉与有机溶液(甲醇：二氯甲烷：水＝4:2:1，v/v/v)混合进行脱色12h，将不溶物置50℃烘箱中干燥至恒重；按料液比1：30加水，室温静置30min；采用传统热水浸提法进行提取，提取温度90℃，提取时间2h；提取产物趁热离心并收集上清液，向其中缓慢加入3倍体积95％的乙醇溶液，4℃静置过夜，离心收集多糖沉淀并将其复溶在0.1mol/lnacl溶液中后，透析、浓缩、冻干，即获得溶解性改良的坛紫菜多糖php。

结果：由图1可知，php的色谱图出现一个典型的对称峰，并且其分子量分布稍微有点广，表明php有一定的离散度，其平均分子量为2.623×10⁵g/mol。传统热水浸提结合纯水复溶法提取的坛紫菜多糖的特性粘度为806.08ml/g，而本发明方法制备的坛紫菜多糖的特性粘度为491.70ml/g。据报道，特性粘度较小的多糖具有更好的溶解性能，且其表面结构更容易被破坏，因此这样一个低特性粘度值表现出更强的发酵性能。

实施例2：人体肠道菌群发酵php

肠道菌群基础培养基的制备：2.0g酵母提取物,2.0g蛋白胨,0.02g氯化血红素,0.5gl-半胱氨酸,0.5g胆盐,2.0gnahco3,0.1gnacl,0.04gkh2po4,0.04gk2hpo4,0.01gcacl2·6h2o,0.01gmgso4·7h2o,0.01g维生素k1,0.01g刃天青以及2.0mltween-80溶解在1.0l蒸馏水中，于121℃灭菌20min.

粪便接种液的制备及发酵：招募没有胃肠道疾病史且两月内没有接受过任何抗生素治疗的四名健康志愿者(两男两女，年龄20-22岁)。将收集的新鲜粪便样品均匀分散在无菌无氧的生理盐水中(0.9％，w/v)，形成10％(w/v)粪便悬浮液；在500×g条件下离心5min除去不溶性颗粒；然后，将1.0ml的粪便接种液注射到9.0ml基础培养液中。其中，php组：含100mgphp；nc组：不添加任何碳源；pc组：含100mg低聚果糖(fos)。在37℃恒温厌氧培养0、6、12和24h时取出，高速离心。

实施例3：php对人体肠道菌群结构组成的影响

dna的提取及pcr扩增：在高速离心后获得的沉淀中加入1ml0.1mol/l的pbs缓冲液重悬菌体。用qiaampdnastoolminikit提取每个发酵样品的总dna。在pcr反应体系中使用正向引物gc-338f(5’-cgcccggggcgcgccccggggcggggcgggggcgcggggggcctacgggaggcagcag-3’)和反向引物518r(5’-attaccgcggctgctgg-3’)扩增细菌16srdna的v3区域。

pcr扩增体系和程序为：10×pcrbuffer5μl；dntp(2.5mm)3.2μl；rtaq(5u/μl)0.4μl；gc-338f(20μm)1μl；518r(20μm)1μl；模板dna50ng；补ddh2o至50μl。94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸1min，30个循环；最终72℃延伸10min。

pcr产物的变性梯度凝胶电泳(dgge)分析：取10μlpcr的产物进行dgge分析。采用变形梯度为35％～55％、浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶(化学变性剂为100％尿素7mol/l和40％(v/v)的丙烯酰胺)，在1×tae缓冲液中56v60℃下电泳14h，采用银染法进行染色。用灭菌的手术刀切下待回收dgge条带，采用omega公司poly-geldnaextractionkit回收目的条带。以2μl回收产物为模板，338f/518r为引物进行pcr扩增，pcr扩增体系和程序与上述相同。将重新扩增的dna片段切胶回收、纯化后，连接到pmd18-t载体上，并转化至dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。测序结果与genbank中的序列进行比对，得到条带所代表的细菌类型。每个回收条带选取3个克隆进行了序列测定。

表1.在dgge上差异条带的菌种鉴定

结果：如图2和表1所示，php处理的肠道菌群的结构组成发生了明显的改变。在发酵6h时，条件致病菌表现出较强的生长优势，开始增殖；而随着发酵时间的延长，致病菌的生长被抑制，益生菌开始大量生长，最终表现为促进了多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、defluviitaleasaccharophila、普拉梭菌(faecalibacteriumprausnitzii)等肠道益生菌的增殖；虽然nc组的菌群组成也发生了变化，但条件致病菌的多样性和丰度却明显增加，而这些致病菌因不能利用php和fos，其生长受到抑制，因此，在php或pc组中表现出的丰度水平较nc组明显降低或完全消失。

实施例4：php对人体肠道菌群产生scfa的影响

scfa的测定：将高速离心后获得的发酵上清液用0.22μm的滤膜过滤。在0.45ml的过滤上清液中加入0.02ml6mol/lhcl和0.03ml2-乙基丁酸，混合。在gc-2010系统，通过db-waxetr柱(30cm×0.25mm×0.25μm)对各种短链脂肪酸进行分离，fid检测器对其进行检测。升温程序为：初始柱温90℃维持1min，以5℃/min的速率增加到200℃，分流比1:9，进样量1μl。

结果：如表2所示，在三组中，总scfas的产量随着发酵时间的推移而持续增加。在大致相同的初始条件下，发酵24h后总scfas的浓度达到32.321±1.813mmol/l，显著高于nc组的19.369±1.002mmol/l以及pc组的26.618±1.445mmol/l，这说明php具有较好的产scfas的能力。乙酸是主要的scfa产物，当php作为唯一碳源时，发酵24h的最高乙酸浓度是17.705±0.833mmol/l，显著高于fos作为碳源或者不添加任何碳源的对照组。丙酸是第二丰富的scfa产物，相对于nc组的3.812±0.193mmol/l和pc组的5.380±0.349mmol/l，在经过php发酵产生了较高的丙酸，其产量为11.432±0.702mmol/l。然而，在php组的正丁酸的产量高于nc组，却低于pc组，但是两者均没有显著性差异。对于异丁酸、戊酸、异戊酸，三者产量均随着发酵时间的延长浓度增大，且php组的scfas的产生浓度均高于nc组。综上所述，php可以促进肠道菌群产生大量的scfa，从而对机体发挥生理作用。

表2.不同时间点体外酵解液中scfas的浓度

¹同一列中不同的上标小写字母和大写字母分别表示在不同组间和不同处理时间之间存在显著差异(n＝3,p<0.05)；

²nd：低于检测下限。

实施例5：php微观结构对其发酵特性的影响

扫描电镜观察：将分别经过0h、6h、12h、24h的多糖降解产物冻干，利用jsm-6360la扫描电镜观察其表面形态和微观结构，图像分别放大300倍、1000倍和5000倍。

结果：如图2所示，php是多孔网状结构，当图像放大到5000倍时，可以看出php表面光滑。随着发酵时间的延长，php不断被肠道菌群降解。当发酵6h时，可以观察到php表面层破碎，而在表面层的下面是一层致密结构；随着php进一步发酵，表面层几乎完全被消化，而致密层完全暴露，可以清楚的看出，致密层由饱满光滑的球形颗粒组成；当发酵24h时，内层致密结构变得疏松多孔，球形颗粒的尺寸明显缩减，而在这段发酵时间中，有益菌呈现较强的生长优势，scfa产物大量产生；因此推测，php的内层结构是其核心结构，php结构可能是由对细菌不太有利的外层和容易利用的内层组成。然而，php的这种结构展现了一种延迟的发酵行为，因为不太有利的外层必须优先被降解，核心结构才能暴露出来供肠道益生菌生长和利用。

实施例6：php酸奶咀嚼片的制备

1、坛紫菜多糖酸奶的制备

(1)原料调配：按新鲜牛乳的重量百分比添加坛紫菜多糖5-10份、蔗糖5-10份、木糖醇6-8份、果胶0.2-0.5份充分混合均匀，牛乳定量至100份；

(2)预热和均质：将步骤(1)充分搅拌混匀的混合乳预热到50-60℃，然后转移至均质机中进行均质，均质压力为20-25mpa；

(3)灭菌与冷却：在85-95℃下保持15-20min进行灭菌，随后冷却至40-45℃；

(4)接种：将3-5份混合菌种发酵剂加入到步骤(3)中冷却后的混合乳中，搅拌均匀使发酵剂均匀分布，迅速封口；

(5)发酵：接种后的混合乳在42℃条件下保温发酵4-6h，待完全凝乳后停止发酵，并立即在4℃的条件下冷却；

2、酸奶咀嚼片的制备

(6)将发酵好的酸奶与其重量份的辅料成分混合均匀：硬脂酸镁0.5-1份，丝胶肽1-2份。经过-20℃预冻至少12h后，真空冷冻干燥24h，将冻干后的酸奶粉取出，加入淀粉15-20份，混匀研磨，确保颗粒成细粉状态；

(7)对步骤(6)中获得的酸奶粉进行压片前用对压片机进行清洁消毒，保持制作过程达到食品级要求，然后在20kn的压力下将酸奶粉压片成粒。

混合菌种发酵剂包括乳酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌任选两种等质量比组配。