本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种慢病毒的纯化方法。
背景技术：
慢病毒在基因治疗及细胞治疗等领域具有非常广泛的应用，是一种重要的外源基因递送载体。基因治疗及细胞治疗对慢病毒的纯度和滴度有极高的要求。现有的慢病毒的生产制备工艺虽然能够实现大规模、高纯度、高滴度的要求，但还存在回收率低的问题。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种提高慢病毒的回收率的纯化方法。
一种慢病毒的纯化方法，在纯化的超滤浓缩过程中使用选自蔗糖、山梨醇、麦芽糖、海藻糖和甘露醇中的至少一种的添加剂来辅助浓缩。
经证实，上述慢病毒的纯化方法能够有效提高慢病毒浓缩纯化中慢病毒的回收率。
在其中一个实施例中，所述超滤浓缩包括以下步骤：
将由慢病毒培养液上清经初级纯化得到的初级纯化液与所述添加剂混合，得到混合液；
将所述混合液超滤浓缩，得到超滤物；及
用缓冲液清洗所述超滤物，得到纯化的慢病毒。
在其中一个实施例中，所述添加剂为蔗糖，所述混合液中所述蔗糖的摩尔浓度为2.92mm～292mm；或所述添加剂为山梨醇，所述混合液中所述山梨醇的摩尔浓度为10mm～1000mm；或所述添加剂为麦芽糖，所述混合液中所述麦芽糖的摩尔浓度为10mm～1000mm；或所述添加剂为海藻糖，所述混合液中所述海藻糖的摩尔浓度为10mm～1000mm；或所述添加剂为甘露醇，所述混合液中所述甘露醇的摩尔浓度为5.5mm～548.9mm。
在其中一个实施例中，所述添加剂为蔗糖、山梨醇、麦芽糖、海藻糖及甘露醇的混合物，所述混合液中所述蔗糖的摩尔浓度为2.92mm～233mm，所述混合液中所述麦芽糖的摩尔浓度为10mm～200mm，所述混合液中所述山梨醇的摩尔浓度为10mm～200mm，所述混合液中所述海藻糖的摩尔浓度为10mm～200mm，所述混合液中所述甘露醇的摩尔浓度为5.5mm～275mm。
在其中一个实施例中，所述将由慢病毒培养液上清经初级纯化得到的初级纯化液与所述添加剂混合，得到混合液的步骤包括：将所述添加剂加入所述初级纯化液中，混合均匀，并静置至少10min，得到所述混合液。
在其中一个实施例中，所述将所述混合液超滤浓缩的步骤包括：在4℃～28℃下，将所述混合液用超滤膜包、中空纤维膜包或超滤浓缩管浓缩。
在其中一个实施例中，所述超滤浓缩包括以下步骤：将由慢病毒培养液上清经初级纯化得到的初级纯化液超滤浓缩，得到所述超滤物；将所述超滤物与所述添加剂混合后，得到预置换物；及用缓冲液清洗所述预置换物，得到纯化的慢病毒。
在其中一个实施例中，所述缓冲液中也含有所述添加剂，所述缓冲液中所述添加剂的质量百分数为0.1％～10％。
在其中一个实施例中，所述由慢病毒培养液上清经初级纯化得到初级纯化液的过程包括以下步骤：将所述慢病毒培养液上清离心、过滤，得到离心液；及将所述离心液与核酸酶混合，然后用0.8μm～0.45μm滤膜过滤，得到所述初级纯化液。
在其中一个实施例中，还包括在0.8μm～0.45μm滤膜过滤之后，将得到的滤液经离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析或亲和层析以得到所述初级纯化液的步骤。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面主要结合慢病毒的纯化方法进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的慢病毒的纯化方法，包括以下步骤：
s110、将慢病毒培养液上清初级纯化，得到初级纯化液。
具体地，将慢病毒培养液上清离心、过滤，收集上清，得到离心液。然后0.8μm～0.45μm滤膜过滤，得到滤液。此滤液即为初级纯化液。将慢病毒培养液上清离心以去除大片段的细胞碎片。0.8μm～0.45μm滤膜用于过滤去除小片段的细胞细胞碎片。进一步地，在0.8μm～0.45μm滤膜过滤之前将离心液与核酸酶混合，然后再进行滤膜过滤。在离心液中加入核酸酶降解慢病毒培养液上清中残留的核酸。初级纯化是将慢病毒培养液上清的初步纯化，去除包括但不限于慢病毒培养液中的细胞碎片、核酸。
进一步地，在4℃～28℃下，将慢病毒培养液上清3000g～5000g离心5min～10min，然后过滤，收集上清，得到离心液。优选地，离心转速为3000g～4000g，离心时间为10min。
进一步地，离心液与核酸酶的体积比为1:5000～1:20000。优选地，离心液与核酸酶的体积比为1:5000～1:10000。
进一步优选地，滤膜的孔径为0.45μm。
在其中一些实施例中，还包括将滤液经离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析或亲和层析以得到初级纯化液的步骤。对滤液的进一步纯化，使超滤之前的初级纯化液中的杂质组分更少，更利于超滤的进行。当然，离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析或亲和层析也可以在超滤之后进行。
s130、将初级纯化液超滤浓缩，得到纯化的慢病毒。
具体地，步骤s130包括s131～s135。
s131、将由慢病毒培养液上清经初级纯化得到的初级纯化液与添加剂混合，得到混合液。其中，添加剂选自蔗糖、山梨醇、麦芽糖、海藻糖及甘露醇中的至少一种。添加剂在混合液中的质量百分数0.1％～10％。
进一步地，添加剂选蔗糖、海藻糖、山梨醇中的至少一种。添加剂在混合液中的质量百分数2％～10％。
进一步地，将添加剂加入初级纯化液中，混合均匀，并静置至少10min，得到混合液。优选地，静置时间为15min～30min。
在其中一个实施例中，添加剂为蔗糖，混合液中蔗糖的摩尔浓度为2.92mm～292mm。进一步地，混合液中蔗糖的摩尔浓度为146mm～233mm。
在其中一个实施例中，添加剂为山梨醇，混合液中山梨醇的摩尔浓度为10mm～1000mm。进一步地，混合液中山梨醇的摩尔浓度为100mm～200mm。
在其中一个实施例中，添加剂为麦芽糖，混合液中麦芽糖的摩尔浓度为10mm～1000mm。进一步地，混合液中麦芽糖的摩尔浓度为100mm～200mm。
在其中一个实施例中，添加剂为海藻糖，混合液中海藻糖的摩尔浓度为10mm～1000mm。进一步地，混合液中海藻糖的摩尔浓度为100mm～200mm。
在其中一个实施例中，添加剂为甘露醇，混合液中甘露醇的摩尔浓度为5.5mm～548.9mm。进一步地，混合液中甘露醇的摩尔浓度为55mm～275mm。
在其中一个实施例中，添加剂为蔗糖及山梨醇，混合液中蔗糖的摩尔浓度为146mm。混合液中山梨醇的摩尔浓度为100mm。
在其中一个实施例中，添加剂为海藻糖及山梨醇的混合物，混合液中海藻糖的摩尔浓度为10mm～200mm。混合液中山梨醇的摩尔浓度为10mm～200mm。
在其中一个实施例中，添加剂为山梨醇、麦芽糖以及甘露醇的混合物，混合液中山梨醇的摩尔浓度为10mm～100mm，混合液中麦芽糖的摩尔浓度为10mm～200mm，混合液中甘露醇的摩尔浓度为5.5mm～275mm。进一步地，混合液中山梨醇的摩尔浓度为10mm，混合液中麦芽糖的摩尔浓度为200mm，混合液中甘露醇的摩尔浓度为5.5mm。
在其中一个实施例中，添加剂为蔗糖、山梨醇、海藻糖、麦芽糖以及甘露醇的混合物，混合液中蔗糖的摩尔浓度为58.4mm，混合液中山梨醇的摩尔浓度为50mm，混合液中麦芽糖的摩尔浓度为10mm，混合液中海藻糖的摩尔浓度为50mm，混合液中甘露醇的摩尔浓度为27.5mm。
s133、将混合液超滤浓缩，得到超滤物。
具体地，在4℃～28℃下，用超滤膜浓缩混合液，得到超滤物。进一步地，将混合液用超滤膜包、中空纤维膜包或超滤浓缩管浓缩，得到超滤物。优选地，将混合液用孔径为100kd的超滤膜包、中空纤维膜包或超滤浓缩管浓缩。
s135、用缓冲液清洗超滤物，得到纯化后的慢病毒。
具体地，用缓冲液清洗超滤物，得到回收液。此时，经过超滤纯化的慢病毒处于回收液中。进一步地，缓冲液中也含有添加剂，缓冲液中添加剂的质量百分数0.1％～10％。每次清洗加入缓冲液与超滤物的体积比为1：1，共清洗1～7次。
进一步地，缓冲液中添加剂的质量百分数为2％～10％。
进一步地，用缓冲液清洗超滤膜，并合并到回收液中。清洗超滤膜并合并到回收液中，可以将附着在超滤膜上的慢病毒纳入回收液，避免不必要的损失。
当然，在一些实施例中，也可以先将初级纯化液超滤，得到超滤液。然后将超滤液与添加剂混合后，得到预置换物。接着用缓冲液置换预置换物，得到纯化后的慢病毒。只要在纯化的超滤浓缩的产物中加入添加剂即可。在超滤浓缩的产物用缓冲液清洗置换之前加入添加剂能够减少添加剂的用量，节省添加剂的成本。
进一步地，预置换物中添加剂的质量百分数为0.1％～10％。优选地，预置换物中添加剂的质量百分数为2％～10％。
进一步地，在其中一个实施例中，添加剂为蔗糖，预置换物中蔗糖的摩尔浓度为2.92mm～292mm。进一步地，预置换物中蔗糖的摩尔浓度为146mm～233mm。
在其中一个实施例中，添加剂为山梨醇，预置换物中山梨醇的摩尔浓度为10mm～1000mm。进一步地，预置换物中山梨醇的摩尔浓度为100mm～200mm。
在其中一个实施例中，添加剂为麦芽糖，预置换物中麦芽糖的摩尔浓度为10mm～1000mm。进一步地，预置换物中麦芽糖的摩尔浓度为100mm～200mm。
在其中一个实施例中，添加剂为海藻糖，预置换物中海藻糖的摩尔浓度为10mm～1000mm。进一步地，预置换物中海藻糖的摩尔浓度为100mm～200mm。
在其中一个实施例中，添加剂为甘露醇，预置换物中甘露醇的质量百分数为5.5mm～548.9mm。进一步地，预置换物中甘露醇的摩尔浓度为55mm～275mm。
在其中一个实施例中，添加剂为蔗糖及山梨醇的混合物，预置换物中蔗糖的摩尔浓度为146mm。预置换物中山梨醇的摩尔浓度为100mm。
在其中一个实施例中，添加剂为海藻糖及山梨醇的混合物，预置换物中海藻糖的摩尔浓度为10mm～200mm。预置换物中山梨醇的摩尔浓度为10mm～200mm。
在其中一个实施例中，添加剂为山梨醇、麦芽糖以及甘露醇的混合物，预置换物中山梨醇的摩尔浓度为10mm～100mm，预置换物中麦芽糖的摩尔浓度为10mm～200mm，预置换物中甘露醇的摩尔浓度为5.5mm～275mm。进一步地，预置换物中山梨醇的摩尔浓度为10mm，预置换物中麦芽糖的摩尔浓度为200mm，预置换物中甘露醇的摩尔浓度为5.5mm。
在其中一个实施例中，添加剂为蔗糖、山梨醇、海藻糖、麦芽糖以及甘露醇的混合物，预置换物中蔗糖的摩尔浓度为58.4mm，预置换物中山梨醇的摩尔浓度为50mm，预置换物中麦芽糖的摩尔浓度为10mm，预置换物中海藻糖的摩尔浓度为50mm，预置换物中甘露醇的摩尔浓度为27.5mm。
经证实，上述慢病毒的纯化方法操作简便，且能够显著提高慢病毒的回收率。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例，如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
以下实施例中的材料为市售产品，其中，核酸酶为七海复泰生物科技产品，山梨醇为adamasreagent产品，纯度为＞99％，麦芽糖为国药沪试产品，纯度为＞99％，甘露醇为adamasreagent产品，纯度为＞99％，蔗糖为上海生工，纯度为＞99％，海藻糖为国药沪试产品，纯度为＞99％。
实施例1～23的具体步骤如下：
(1)在4℃下，收集慢病毒培养液上清，3000g离心5min后收集离心上清，得到离心液，然后按照核酸酶与离心液的体积比1：5000混合，接着使用0.45μm孔径滤膜过滤，得到初级纯化液。
(2)将初级纯化液与添加剂混合，并静置15min，得到混合液。添加剂的组分和添加剂在混合液中浓度如表1所示。
表1
(3)在4℃下，将步骤(2)得到的混合液用孔径为100kd的超滤浓缩管浓缩，得到超滤物。
(4)用pbs缓冲液清洗超滤物，超滤物与缓冲液的体积比为1：1，得到回收液。用缓冲液清洗超滤浓缩管，并合并到回收液中，得到纯化的慢病毒。
(5)取步骤(4)得到的纯化的慢病毒，采用流式细胞仪检测慢病毒的感染效率，按照以下公式计算慢病毒回收率：
活性滴度＝(细胞量*感染效率)/检测时加入慢病毒样品体积；
总活性病毒颗粒数＝活性滴度*慢病毒液总体积；
回收率＝实验组总活性病毒颗粒数/相同体积浓缩前慢病毒总活性颗粒数；
实施例1～实施例16的慢病毒回收率的结果如表1所示。
实施例17～实施例23
(1)在4℃下，收集慢病毒培养液上清，3000g离心5min后收集离心上清，得到离心液，然后按照核酸酶与离心液的体积比1：5000混合，接着使用0.45μm孔径滤膜过滤，得到初级纯化液。
(2)在4℃下，将步骤(1)得到的初级纯化液用孔径为100kd的超滤膜包浓缩，得到超滤物。
(3)将步骤(2)超滤物与添加剂混合后，静置30min，得到预置换物。添加剂的组分和添加剂在预置换物中浓度如表2所示。
表2
(4)用含有相应添加剂的pbs缓冲液清洗超滤物，每次清洗超滤物与缓冲液的体积比为1：1，清洗5次，得到回收液。再用含有相应添加剂的缓冲液清洗超滤膜，并合并到回收液中，得到纯化的慢病毒。
(5)取步骤(4)得到的纯化的慢病毒，采用流式细胞仪检测慢病毒的感染效率，按照以下公式计算慢病毒回收率：
活性滴度＝(细胞量*感染效率)/检测时加入慢病毒样品体积；
总活性病毒颗粒数＝活性滴度*慢病毒液总体积；
回收率＝实验组总活性病毒颗粒数/相同体积浓缩前慢病毒总活性颗粒数；
实施例17～23的慢病毒回收率的结果如表2所示。
由表1及表2可以看出，实施例1～15及实施例17～22的添加剂在慢病毒浓缩缓冲液置换过程中，可以显著的提高慢病毒活性颗粒的稳定性，提高慢病毒的回收率。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。