蓝果忍冬SRAP反应体系的建立的制作方法

本发明属于分子生物学领域，主要涉及蓝果忍冬srap反应体系的建立。

背景技术：

相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism，srap)又叫做基于序列扩增多态性(sequence-baseamplifiedpolymorphism，sbap)，是由美国加州大学蔬菜作物系li和quiros博士于2001年提出。该标记技术也是一种基于简单pcr的新的标记系统，它主要是通过独特的引物设计对开放阅读框(orf)进行扩增，引物由核心序列和3个选择性碱基组成，其中核心序列含非特异性填充序列和特异性序列两部分。srap-pcr反应体系使用两个引物，17碱基上游引物和18碱基下游引物。上游引物对外显子进行特异扩增，下游引物对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，由于个体不同及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等，使得扩增出基于内含子与外显子的srap多态性标记。

srap作为一种新型的分子标记，具有操作简单、稳定和高效等特点，广泛应用于不同作物的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析各种研究，与其他pcr技术类似，其扩增结果易受到反应因素的影响，因此，进行srap体系的优化是获得较好研究结果的先决条件。

dntps是pcr的原料，浓度过高，会导致pcr错配，从而出现非特异性扩增，浓度过低，则又影响合成效率，同时dntps分子中的磷酸基团能定量地与mg2+结合，使实际反应中的mg2+浓度下降，进而影响tagdna聚合酶的活力。

mg²⁺是tagdna聚合酶的激活剂，其浓度不仅影响tagdna聚合酶的活性，还能与反应液中的dntps、模板dna及引物结合，影响引物与模板的结合效率、模板与pcr产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成。mg²⁺是影响pcr扩增最大的因子，因此，选择合适的mg²⁺浓度，对pcr反应至关重要。

tagdna聚合酶在pcr中的用量受反应体积、酶的活性及酶的耐热性等因素制约，使用高浓度的tag酶不仅造成经济上的浪费，而且容易导致非特异性扩增产物积累，电泳呈弥散状；tag酶用量偏低会使新链合成效率下降，导致扩增产物减少。

引物浓度偏低，会使引物与模板的结合率降低，产生的多态性条带减少；随着引物浓度增加，其条带亮度和数目增加，但引物浓度也不能太高，过高的引物浓度会导致非特异性扩增和引物二聚体的形成，从而与靶序列竞争tag酶和dntps，影响靶序列的产量。

模板dna的含量是制约扩增产物得率及特异性的一个重要因素，其完整性对扩增结果具也有很大影响。在银杉研究中发现，dna模板中残留的微量氯仿、ctab、异丙醇等往往影响扩增结果，在实验中应尽量去除。一般来说，dna浓度有一个比较宽的使用范围，一般为20～80ng。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种蓝果忍冬srap反应体系，简单、稳定、高效的获得丰富的多态性dna，以应用于蓝果忍冬的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析等。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

1、蓝果忍冬srap反应体系的建立，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)采用单因素试验对体系进行优化，基本反应条件为反应总体积20μl，其中10×pcrbuffer2μl、mgcl22.5mmol/l、dntps0.15mmol/l、引物0.1μmol/l、模板dna20ng、tagdna聚合酶1.5u，不足部分用双蒸水补足，进行反应。

(2)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度tagdna聚合酶反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的tagdna聚合酶浓度。

(3)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度模板dna反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的模板dna浓度。

(4)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度dntps反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的dntps浓度。

(5)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度mg2+反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的mg2+浓度。

(6)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度引物反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的引物浓度。

(7)确定蓝果忍冬srap最佳反应条件，在多个蓝果忍冬品种样品上检验反应体系的稳定性和可靠性。

2、根据权利要求1所述的蓝果忍冬srap反应体系的建立，其特征在于，步骤(1)所述的反应程序为：94℃预变性2-5min；94℃变性1-2min，35℃复性1-2min，72℃延伸1-2min，5个循环；94℃变性1-2min，50℃复性1-2min，72℃延伸1-2s，35个循环；72℃延伸5-10min。

3、根据权利要求1所述的蓝果忍冬srap反应体系的建立，其特征在于，步骤(2)所述的tagdna聚合酶浓度梯度为0.5-2.0u。

4、根据权利要求1所述的蓝果忍冬srap反应体系的建立，其特征在于，步骤(3)所述的模板dna浓度梯度为10-40ng。

5、根据权利要求1所述的蓝果忍冬srap反应体系的建立，其特征在于，步骤(4)所述的dntps浓度梯度为0.1-0.25mmol/l。

6、根据权利要求1所述的蓝果忍冬srap反应体系的建立，其特征在于，步骤(5)所述的mg2+浓度梯度为1.0-2.5mmol/l。

7、根据权利要求1所述的蓝果忍冬srap反应体系的建立，其特征在于，步骤(6)所述的引物浓度梯度为0.1-0.4μmol/l。

8、根据权利要求1所述的蓝果忍冬srap反应体系的建立，其特征在于，步骤(7)所述的蓝果忍冬品种包括长白山野生型蓝果忍冬、库页岛蓝果忍冬、大兴安岭野生蓝果忍冬、勃利蓝果忍冬，蓝果忍冬srap-pcr的最佳反应体系(20μl)为：2.0μl10×pcrbuffer、1.0-2.0utagdna聚合酶、20-40ng模板dna、0.15-0.25mmol/ldntps、1.5-2.5mmol/lmg2+、0.1-0.2μmol/l引物。

蓝果忍冬srap反应体系的建立属于分子生物学领域，srap作为一种新型的分子标记，具有操作简单、稳定和高效等特点，广泛应用于不同作物的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析各种研究，与其他pcr技术类似，其扩增结果易受到tagdna聚合酶、模板dna、dntps、mg2+、引物等反应因素的影响，因此，进行srap体系的优化是获得较好研究结果的先决条件。建立蓝果忍冬srap反应体系，能够简单、稳定、高效的获得丰富的多态性dna，以应用于蓝果忍冬的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析等。

附图说明

附图1为本技术路线图。

具体实施方式

实例一：(1)采用单因素试验对体系进行优化，基本反应条件为反应总体积20μl，其中10×pcrbuffer2μl、mgcl22.5mmol/l、dntps0.15mmol/l、引物0.1μmol/l、模板dna20ng、tagdna聚合酶1.5u，不足部分用双蒸水补足，进行反应。

(2)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置tagdna聚合酶浓度为0.5u反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的tagdna聚合酶浓度。

(3)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置模板dna浓度为10ng反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的模板dna浓度。

(4)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置dntps浓度为0.1mmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的dntps浓度。

(5)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置mg²⁺浓度为1.0mmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的mg2+浓度。

(6)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置引物浓度为0.1μmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的引物浓度。

(7)确定蓝果忍冬srap最佳反应条件，在多个蓝果忍冬品种样品上检验反应体系的稳定性和可靠性。

实例二：(1)采用单因素试验对体系进行优化，基本反应条件为反应总体积20μl，其中10×pcrbuffer2μl、mgcl22.5mmol/l、dntps0.15mmol/l、引物0.1μmol/l、模板dna20ng、tagdna聚合酶1.5u，不足部分用双蒸水补足，进行反应。

(2)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置tagdna聚合酶浓度为1.0u反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的tagdna聚合酶浓度。

(3)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置模板dna浓度为20ng反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的模板dna浓度。

(4)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置dntps浓度为0.15mmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的dntps浓度。

(5)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置mg2+浓度为1.5mmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的mg2+浓度。

(6)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置引物浓度为0.2μmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的引物浓度。

(7)确定蓝果忍冬srap最佳反应条件，在多个蓝果忍冬品种样品上检验反应体系的稳定性和可靠性。实例三：

(1)采用单因素试验对体系进行优化，基本反应条件为反应总体积20μl，其中10×pcrbuffer2μl、mgcl22.5mmol/l、dntps0.15mmol/l、引物0.1μmol/l、模板dna20ng、tagdna聚合酶1.5u，不足部分用双蒸水补足，进行反应。

(2)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置tagdna聚合酶浓度为1.5u反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的tagdna聚合酶浓度。

(3)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置模板dna浓度为30ng反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的模板dna浓度。

(4)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置dntps浓度为0.2mmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的dntps浓度。

(5)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置mg²⁺浓度为2.0mmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的mg2+浓度。

(6)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置引物浓度为0.3μmol/l反应。取10μl反应终产物加lμl6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为l×tae，电泳电场强度为5v/cm，gofdview染色，alphalmagerhp凝胶成像系统下观察照像并记录。选出有清晰明亮条带的引物浓度。

(7)确定蓝果忍冬srap最佳反应条件，在多个蓝果忍冬品种样品上检验反应体系的稳定性和可靠性。