伏马毒素降解酶FumDXA及其基因和应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及伏马毒素降解酶fumdxa及其基因和应用。

背景技术：

伏马毒素(fumonisin，fb)是镰刀菌属(fusariumspp.)在特定的条件下产生的一些水溶性的次级代谢产物。伏马毒素是由多氢醇和丙三羧酸组成双酯类化合物，结构中的主要活性官能团是伯胺、三羧酸、羟基和脂肪族骨架，这些与它们的毒性效应密切相关。研究表明，伏马毒素可引起大鼠肾肿瘤和肝癌、马脑白质软化症(elem)，猪肺水肿(ppe)等，且与人类食管癌的发病密切相关。到目前为止，发现了28种伏马毒素的类似物，将其分为四类，即fa、fb、fc和fp，在b系列中，最常发现的是伏马菌素b1(fb1)、b2(fb2)和b3(fb3)，其中fb1量在自然界中的量大约占70％-80％左右，其毒性最强，污染最广泛。应用物理、化学的方法能将伏马毒素去除，但是，化学方法局限性比较大，虽然能降低fb1的含量，但会引入新的化学物质，增加安全隐患，此外欧盟也禁止使用化学方法消除真菌毒素。物理方法可去除一定量的fb1，但要求条件高，且易改变食品品质和风味。生物降解法降解fb1反应温和，专一性强，特异性高，应用前景非常广阔。

真菌毒素的污染在全球范围内都在日益加剧，其造成宝贵的粮食资源的浪费，且对人具有致癌性。因此，研发降解真菌毒素的酶制剂，可以很好的遏制被污染的粮食作物中的毒素的产生，挽回经济损失。

技术实现要素：

为了能够利用生物降解法降解伏马毒素，本发明提供一种伏马毒素降解酶fumdxa及其基因和应用。

本发明的目的在于提供一种伏马毒素降解酶fumdxa。

本发明的再一目的在于提供一种伏马毒素降解酶fumdxa的基因。

本发明的再一目的在于提供一种含有伏马毒素降解酶fumdxa基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供一种含有伏马毒素降解酶fumdxa基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供制备上述伏马毒素降解酶fumdxa的方法。

本发明的再一目的在于提供上述伏马毒素降解酶fumdxa的应用。

根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶fumdxa，其氨基酸序列如seqidno.1所示：

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其中，该酶基因编码493个氨基酸和一个终止密码子，没有信号肽，因此，成熟的伏马毒素降解酶fumdxa的理论分子量为53kda。

本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶fumdxa的基因，该基因的基因组序列如seqidno.2所示：

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本发明通过pcr的方法分离克隆了降解酶fumdxa基因，dna全序列分析结果表明，降解酶fumdxa结构基因全长1482bp。

将伏马毒素降解酶fumdxa基因序列及氨基酸序列在genbank中进行blast比对，该序列与来源于鞘氨醇盒菌mta144氨基酸序列一致性为46％，说明本发明的伏马毒素降解酶fumdxa是一种新的fb1降解酶。

本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶fumdxa的重组载体，将优选重组载体命名为pet28a-fumdxa。将本发明的降解酶fumdxa基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的解毒酶基因插入到质粒pet28a上的ecori和xhol限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于t7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pet28a-fumdxa。

本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶fumdxa的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌。

本发明还提供了一种制备伏马毒素降解酶fumdxa的方法，包括以下步骤：

(1)用包含编码伏马毒素降解酶fumdxa的基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导伏马毒素降解酶fumdxa表达；

(3)分离纯化获得的伏马毒素降解酶fumdxa。

其中，优选所述宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选为大肠杆菌bl21(de3)。

本发明还提供上述伏马毒素降解酶fumdxa的应用，尤其是在降解伏马毒素b1的应用。

本发明的伏马毒素降解酶fumdxa的最适温度30℃，最适ph为9.0，在ph7-10范围内仍保持60％以上的活性。在最适温度和最适ph下，本发明的伏马毒素降解酶fumdxa对fb1的降解率为100％。

应用本发明的方法可以获得性质优良的伏马毒素b1伏马毒素降解酶，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素b1对动物及人类健康的危害。

附图说明

图1为伏马毒素降解酶fumdxa的sds-page纯化图，其中，m：蛋白marker；1:伏马毒素降解酶fumdxa；

图2显示伏马毒素降解酶fumdxa的最适温度情况；

图3显示伏马毒素降解酶fumdxa的最适ph情况。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pet28a(+)及菌株bl21(de3)。

2、培养基：

大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl，ph7.0)。

实施例1克隆伏马毒素降解酶fumdxa

利用人工化学合成的方法获得来源于xenophilusazovoran的伏马毒素降解酶fumdxa的基因片段，并在5’端引入内切酶位点ecori、在3’端引入内切酶位点xhoi。

实施例2重组伏马毒素降解酶fumdxa的制备

将表达载体pet28a进行双酶切(ecori+xhoi)，同时将编码伏马毒素解毒酶的基因fumdxa双酶切(ecori+xhoi)，切出编码解毒酶的基因片段与表达载体pet28a连接，获得含有降解酶fumdxa的重组质粒pet28a-fumdxa转化至大肠杆菌bl21(de3)，获得重组大肠杆菌菌株bl21(de3)/fumdxa。

取含有重组质粒的bl21(de3)菌株，接种于100mllb培养液中，37℃220rpm振荡培养2-3h后，od600为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmiptg，25℃诱导20h，诱导结束，4℃离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，镍柱纯化后，sds-page结果表明，重组解毒酶在大肠杆菌中得到了表达。如图1所示，泳道1为纯化后的结果。

实施例3伏马毒素降解酶fumdxa的性质测定

高效液相色谱检测伏马毒素降解酶的酶活，具体方法如下：

(1)fb1标准储备液：称1mg标品，用10ml乙腈和水(1：1)溶解，配制成浓度为100ug/ml的标准液，-20℃保存。

(2)样品的制备：取纯化好的伏马毒素降解酶酶液900ul，加入100ul的fb1标准储备液，使fb1的终浓度为10ug/ml，37℃，220rpm，避光培养20min。

(3)样品衍生化：取待测样品100ul，加入400ul50％乙腈水，500ulopa衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与fb1的标品的峰图对比，来确定伏马毒素降解酶fumdxa的酶活性。

1.测定伏马毒素降解酶的最适温度

以fb1为底物，取100μl底物并加入900μl的酶液，终浓度为10μg/ml，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph7.0)缓冲液体系及不同温度下，反应20min，然后沸水煮10min，让酶失活。冷却至室温后过膜，待高效液相色谱检测。

如图2所示，伏马毒素降解酶fumdxa的最适温度为30℃。

2.测定伏马毒素降解酶fumdxa的最适ph

将纯化的重组伏马毒素降解酶fumdxa在不同的ph缓冲液下进行酶促反应，以测定其最适ph，所选用的缓冲溶液的缓冲梯度为100mm柠檬酸-磷酸氢二钠(ph3.0–8.0)，100mm的tris-hcl(ph8.0-9.0)，100mm甘氨酸-naoh(ph9.0–12.0)。伏马毒素降解酶fumdxa在上述不同的缓冲液中与底物fb1(终浓度为1μg/ml)在37℃反应30min，沸水煮10min，高效液相色谱检测。

结果如图3所示，伏马毒素降解酶fumdxa的最适ph为9.0。

同时，本发明还对伏马毒素降解酶fumdxa的温度稳定性和ph稳定性进行测定，结果表明伏马毒素降解酶fumdsb具有较好的温度稳定性和ph稳定性。

序列表

<110>天津科技大学

<120>伏马毒素降解酶fumdxa及其基因和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>493

<212>prt

<213>草酸杆菌(xenophilusazovoran)

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