一种可漂浮易降解的微生物载体及制备方法与应用与流程

本发明涉及一种可漂浮易降解的微生物载体及制备方法与应用。

背景技术：

生物法处理水体中的石油污染具有安全、环保、可靠等优点，但目前在实际应用方面仍然存在许多问题亟待解决。施用游离降解菌与本土微生物存在拮抗作用，而且还存在菌体易流失、对环境条件变化敏感等缺点。石油降解菌株的固定化技术能够初步解决这一问题，在克服游离态菌株与本土微生物的拮抗作用具有一定的效果，但仍然存在载体材料吸油率低、机械强度弱、可降解性差等缺点，限制了生物法处理溢油的大规模推广。

选择适宜的固定化微生物载体是实现产业化的关键，而载体的好坏又取决于材料的吸附率、机械强度、寿命和包埋微生物细胞的活性。理想的载体材料具有吸油率高、可生物降解、廉价、丰富的孔隙等特点。载体材料也应具有悬浮性，悬浮性的载体材料有利于微生物在油水界面繁殖，使微生物更容易与溢油接触。许多载体材料已报道用于修复溢油，然而，寻找吸油率高又具有漂浮性的材料并非易事。活性碳是应用最广泛的固定化载体，制得的修复剂具有漂浮性，但对溢油的吸附率低；使用聚乙烯醇-硼酸二次交联完成细菌固定化用于污水处理，包埋载体有机械强度高、价格低廉等优点，但产品不具有漂浮性，不能用于处理海面的油膜。聚氨酯载体的硝化细菌固定化生物活性填料具有漂浮性，但聚氨酯泡沫不易降解、易造成二次污染。天然有机高分子载体材料对大部分微生物不具有毒性，生物相容性较好，并且价格低廉。但天然有机高分子载体如果不经过其他处理，有机械强度较低，自身很容易被微生物的分解，导致使用寿命较短等缺点。针对天然高分子载体材料存在的诸多缺点，合成制备有机高分子载体材料，可以克服天然高分子材料相关的固有弱点，用来替代天然有机载体材料。本发明提供一种可漂浮易降解的微生物载体材料处理含油污水。

技术实现要素：

针对现有技术存在的缺陷，本发明的一个目的是提供一种可漂浮易降解的载体材料。

本发明所提供的可漂浮易降解的载体材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)将天然高分子凝胶载体溶解于水中形成水溶液，然后向所述水溶液中依次加入自由基捕捉剂、强氧化剂进行氧化反应，得到含醛基的活化中间体的反应液；

2)向步骤1)所述含醛基的活化中间体的反应液中加入氧化终止剂，使所述氧化终止剂与步骤1)中过量的强氧化剂反应，得到所述天然高分子凝胶载体的部分氧化产物；

3)取所述天然高分子凝胶载体的部分氧化产物溶于ph7.0的磷酸盐缓冲液中，向其中加入羰基还原剂还原羰基，然后加入有机合成中间体nh2r，通过醛基与氨基反应后再还原加氢得到含天然高分子凝胶载体上接枝疏水性烷基产物的反应体系，室温搅拌，加入甲醇形成沉淀产物，离心分离，收集沉淀，即为天然高分子凝胶载体上接枝疏水性烷基产物固体(即两亲性产物)；其中，所述nh2r中的r选自c6烷基、c12烷基和c18烷基中的任意一种；

4)将所述天然高分子凝胶载体上接枝疏水性烷基产物固体溶解于水中，再向其中加入有机高分子载体、交联剂进行交联反应，得到可漂浮易降解的载体材料。

上述方法步骤1)中，所述天然高分子凝胶载体选自下述任意一种：海藻酸钠、琼脂、纤维素和壳聚糖，优选海藻酸钠。

所述自由基捕捉剂选自下述任意一种：正丙醇、异丙醇、石墨烯、多壁碳纳米管，优选正丙醇。所述强氧化剂选自高碘酸钠。

步骤1)中所述氧化反应在避光条件下进行，所述氧化反应的反应条件为4℃反应2h。

上述方法步骤2)中，所述氧化终止剂选自下述任意一种：乙二醇、丙二醇、对苯二酚、高锰酸钾，优选乙二醇。

上述方法步骤1)和2)中，所述天然高分子凝胶载体、自由基捕捉剂、强氧化剂、氧化终止剂的质量比依次为(0.5～2.0)：(1～5)：(0.1～0.3)：(1～2)。

当所述天然高分子凝胶载体为海藻酸钠(sa)时，所述天然高分子凝胶载体的部分氧化产物为海藻酸钠部分氧化产物(osa)。

上述方法步骤3)中，所述羰基还原剂选自下述至少一种：nacnbh3、nabh4和phseh等，优选nacnbh3。之所以优选nacnbh3是因为它比其他还原剂更具有反应活性，在中性溶液中，亚胺可以迅速地被nacnbh3还原，且不还原醛基。

上述方法步骤3)中，所述天然高分子凝胶载体的部分氧化产物、羰基还原剂、有机合成中间体的质量比依次为(0.5～2.0)：(0.4～1)：(0.4～2)。

当所述天然高分子凝胶载体为海藻酸钠(sa)、有机合成中间体为十二胺时，得到的天然高分子凝胶载体上接枝疏水性烷基产物为海藻酸钠上接枝疏水性烷基产物sac12。

上述方法步骤4)中，所述有机高分子载体选自下述任意一种：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚矾、光交联树脂、硅胶和聚氨，优选聚乙烯醇(pva)。

所述交联剂选自下述任意一种：氯化钙、硼酸、己二胺和戊二醛，优选硼酸。

所述天然高分子凝胶载体上接枝疏水性烷基产物、有机高分子载体、交联剂的质量比依次为(1～4)：(0.5～2.5)：(1～4)。

所述交联反应的条件为室温。

本发明的再一个目的是提供一种包埋石油降解菌种的可漂浮易降解固定化材料。

本发明所提供的包埋石油降解菌种的可漂浮易降解固定化材料是按照下述方法制备得到的：1)按照上述制备可漂浮易降解的载体材料的方法步骤1)-步骤3)操作，

2)将制备的所述天然高分子凝胶载体上接枝疏水性烷基产物固体溶解于水中，再向其中加入有机高分子载体、交联剂以及石油降解菌进行交联反应，即得；

其中，所述天然高分子凝胶载体上接枝疏水性烷基产物、有机高分子载体、交联剂、石油降解菌的质量比依次为(1～4)：(0.5～2.5)：(0.02～0.5)：(0.4～0.5)。

本发明中所述石油降解菌选自下述至少一种：泊库岛食烷菌、枯草芽胞杆菌、柴油食烷菌、除烃海杆菌、优雅食烷菌、蜡样芽胞杆菌、海绵假单胞菌和产碱菌，优选泊库岛食烷菌、枯草芽胞杆菌、柴油食烷菌、除烃海杆菌复配，菌种干燥后的质量比例依次为1:5:3:1。

本发明的发明人以导弹药物的思路，根据靶向对象的特点制备降解不同油品成分的吸附材料。基于这些特点，制成具有特异吸附性能的载体材料运送微生物至悬浮油滴处，从而达到吸附降解的效果。具有靶向性的特异性生物分子或基团亲和配位原理合成的功能高分子载体、亲油性强的材料与油滴之间通过靶向基团相互吸引，可以成为清除溢油残油污染的理想载体。制备这种具有高吸附性能的载体可以合成同时具有疏水性和亲水性的两亲性嵌段共聚物，并通过疏水作用构建物理型两亲性材料解决这一难题。利用疏水性烷基改性两亲性海藻酸钠(sac12)反应，微球内部通过疏水基团的疏水缔合作用构建成可逆的三维交联网络，通过设计疏水缔合结构，以疏水基团通过疏水缔合作用形成的疏水微区为交联点，使sac12-pva骨架链交联成宏网络，获得一类新型物理体型的高强度的疏水缔合载体。

附图说明

图1为本发明制备可漂浮易降解的载体材料的工艺流程图。

图2为海藻酸钠烷基化示意图。

图3为实施例1制备的包埋菌种的可漂浮易降解大孔固定化材料的静态接触角以及微生物生长状况。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的泊库岛食烷菌bncc135077、枯草芽胞杆菌bncc124990、柴油食烷菌bncc136655以及除烃海杆菌bncc220310，均购自于北纳生物。

实施例1、制备包埋菌种的可漂浮易降解大孔固定化材料

1)按照图1的流程，取2.0g海藻酸钠(sa)，加入100ml水，搅拌充分溶解，溶液中加入4ml正丙醇作为自由基捕捉剂，从而使水溶液体系中自由基数目减少，再加入0.21g强氧化剂高碘酸钠，置于避光温控摇床中，于4℃氧化反应2h，得到含醛基的活化中间体。

2)向反应液中加入1ml乙二醇作为终止反应试剂，搅拌15min，乙二醇与过量的高碘酸钠氧化反应，乙二醇碳链断裂生成醛，高碘酸被还原为碘酸，冷冻干燥，得到sa的部分氧化产物osa。

3)取2.0gosa溶于100ml的磷酸盐缓冲液(ph7.0)中，加入0.46g氰基硼氢化钠还原羰基，然后加入0.5g十二胺，通过醛基与氨基反应后再还原加氢得到海藻酸钠上接枝疏水性烷基产物sac12(海藻酸钠烷基化如图2所示)，室温搅拌12h，加入甲醇形成沉淀产物，离心分离，得到sac12。

4)取1.75gsac12溶解于60ml水中，加入0.75g聚乙烯醇，加入60ml去离子水，加入1.0mlcacl2(质量浓度2％)-饱和硼酸(质量5％)混合溶液，将1.0ml石油降解菌剂(泊库岛食烷菌bncc135077、枯草芽胞杆菌bncc124990、柴油食烷菌bncc136655、除烃海杆菌bncc220310)(上述1.0ml石油降解菌剂中，干燥的复配菌种质量分别为0.1g、0.5g、0.3g、0.1g)加入到溶液中，机械搅拌，速率1000r/min，交联反应1min后，得到包埋菌种的可漂浮易降解大孔固定化材料。

实施例1制备的包埋菌种的可漂浮易降解大孔固定化材料的静态接触角以及微生物生长状况，如图3所示。

根据杨氏方程可知，当θ大于90°，液滴收缩，沿矿物表面聚集成珠状，矿物表面不易被润湿，表现为疏水，材料的接触角如果大于150°，就会表现出明显的超疏水性。本发明制备的材料载体接触角θ为128.5°。介于90°到150°之间，接近150°，表现为疏水性，有利于吸附石油，可以为石油降解菌提供碳源，同时不是超疏水的结构也保证载体可以为细菌的生长留存所需必要水分和营养。材料表面和孔隙间附着有大量杆状微生物，表明微生物在载体上呈现良好的生长、增殖状态，这也说明载体材料具有良好的生物亲和性，适宜微生物的生长繁殖。

以本发明实施例1所制备的包埋菌种的可漂浮易降解大孔固定化材料为样品，通过常规试验检测并计算其对于对重油、原油和柴油的吸油能力。

吸油能力按照公式(1)、(2)计算：

式中：k为吸油率，g/g；q为保油率，％；m1为样品吸附油品之前的质量；m2为样品浸没于溶液中吸附饱和取出静置约30s后的质量；m3为样品从油中取出继续静置15min后的质量。

平行试验3次，记录实验结果，取平均值，得到m1、m2和m3，计算得到相应的吸油率k和保油率q，结果见表1。

表1实施例1制备的材料对不同油品的吸附性能测试结果

从上述结果可知，本发明的可漂浮易降解材料对重油、原油和柴油等污油的吸油率和保留率都很高，因而具备吸附和降解污油的能力。