本发明涉及一种以磁性fe3o4-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
蔗果低聚糖(fructooligosaccharide，fos)，又称低聚果糖，分子式为：g-f-fn，n＝1-3(g为葡萄糖，f为果糖)，是由1-3个果糖基通过β-2-1糖苷键与蔗糖中的果糖基结合的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖组成的混合物。
由于低聚果糖具有能够有效增殖双歧杆菌、促进肠胃功能、热量低、防止龋齿等有益功能，愈发受到人们青睐，故其工业化生产对人们身体健康以及国民经济化发展具有重要意义。工业上一般以蔗糖为底物利用果糖基转移酶(fructosyltransferase，ec2.4.1.9，fts)的转糖基作用得到低聚果糖，其反应机理如下：
g-f(蔗糖)→g(葡萄糖)+g-f(蔗糖)+g-f-f(蔗果三糖)+g-f-f-f(蔗果四糖)+g-f-f-f-f(蔗果五糖)
目前国内工业化生产低聚果糖的技术主要是液体深层发酵法，这种方法发酵周期长，果糖基转移酶利用率低。而固定化酶法是一种在工业化酶促反应中被广泛使用的技术。固定化酶法凭借其众多优点如酶能被反复利用、可避免被代谢产物污染、降低生产成本成为研究热点。
目前固定化主要有吸附法、包埋法、共价结合等，采用的载体包括大孔树脂、海藻酸钠、有机新型材料等，交联剂的使用以及共价结合法可能造成酶的部分失活、酶催化微环境的改变，甚至导致其反应动力学发生变化。简单的吸附法不适用于大分子物质、不适用于多酶反应。包埋法不易于工业上的大规模生产，会造成产物与底物难分离、酶反应难控制的现象。
2005年，irajghazi等将果糖基转移酶共价固定在经过环氧基团活化的聚甲基丙烯酸酯聚合物上，固定化酶活达25.9u/g载体，低聚果糖浓度最高可达61.5％。但是这种固定化方法所需载体的前处理复杂，固定化酶活不高，酶活回收率有限。2014年，ganaie等人采用壳聚糖珠和藻酸盐珠固定化果糖基转移酶，固定化酶活分别为25u/g载体和43u/g载体，所获得的低聚果糖浓度分别是42.79％和67.75％。这种方法采用构造稳定的基质对菌丝体进行包埋，以壳聚糖珠为载体的固定化酶再循环效率低，而以藻酸盐珠为载体的热稳定性还有待提高。因此，利用一些方法来帮助改善这些缺陷，应用改善后的固定化酶法生产功能广泛的有益物质比如低聚果糖，对于固定化酶的进一步应用有着重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种以磁性fe3o4-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法，先制备果糖基转移酶和磁性fe3o4-多糖微球，再用磁性fe3o4-多糖微球固定化果糖基转移酶。
在本发明的一种实施方式中，所述多糖包括菊粉或果聚糖。
在本发明的一种实施方式中，所述制备果糖基转移酶的具体步骤包括：
(1)将黑曲霉发酵20-48h，抽滤收集湿菌体；
(2)用0.1-0.5mol/l、ph5.0-7.0的柠檬酸-磷酸缓冲液清洗，所得菌体用上述缓冲液制成菌体悬浮液；
(3)破碎菌体，冷冻离心后取上清液；
(4)上清液浓缩后制得粗酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述磁性fe3o4-多糖微球的制备方法包括：配制1-50mg/ml的多糖溶液90-100ml，加入摩尔比为1:2的fecl2和fecl3，在室温下剧烈搅拌，调节ph至9-11，反应0.5-2h后，溶液在40-80℃加热20-40min，过滤，洗涤，冷冻真空干燥，得到磁性fe3o4-多糖微球。
在本发明的一种实施方式中，所述磁性fe3o4-多糖微球中多糖与铁离子的质量比为1:5-1:10。在本发明的一种实施方式中，所述磁性fe3o4-多糖微球固定化果糖基转移酶的具体步骤包括：
(1)取磁性fe3o4-多糖微球加入缓冲液中充分浸泡溶胀，4-5h后进行磁分离；
(2)加入果糖基转移酶酶液固定；
(3)0-5℃静置10-14h；
(4)通过磁场进行分离，用缓冲液反复洗涤沉淀，直至洗涤液中检测不到酶活力，即得到固定化酶。
在本发明的一种实施方式中，所述磁性fe3o4-多糖微球添加量为0.5g；果糖基转移酶的添加量为100-400u/g磁性fe3o4-多糖微球。
本发明的另一个目的是提供一种磁性fe3o4-多糖微球，以多糖菊粉或果聚糖作为吸附剂，利用化学共沉淀方法一步合成。
本发明以菊粉或果聚糖等多糖为载体，通过吸附或包埋四氧化三铁形成的具有磁性的功能性多糖材料，固定化果糖基转移酶。得到的磁性fe3o4-多糖微球能够有效提高载体的稳定性以及酶负载量，兼具强磁响应性的优点，将其应用于果糖基转移酶的固定化。应用固定化酶重复反应6次后，剩余81％酶活，且在不同的温度和ph条件下表现出更好的适应性，适用于工业生产。
具体实施方式
(一)果糖基转移酶酶活的测定
游离果糖基转移酶的测定：用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液配制浓度为10％(w/v)的蔗糖溶液，取50ml底物溶液于恒温夹套酶反应器中，加入0.05ml果糖基转移酶酶液，50℃恒温搅拌反应60min，于沸水中煮沸10min终止反应。
固定化果糖基转移酶的测定：用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液配制浓度为10％(w/v)的蔗糖溶液，取50ml底物溶液于恒温夹套酶反应器中，加入0.1g固定化酶，50℃恒温搅拌反应60min，反应结束后利用磁场快速将产物和固定化酶分开。
酶活定义：在上述条件下，每分钟生产1μmol蔗果三糖所需要的酶量。
(二)hplc法测定糖组分和含量
agilent1100系列，配有shodexri-101示差折光检测器和m70数据处理器；色谱柱，shodexasahipak(型号)；流动相，乙腈：水＝75:25，流速1ml/min；温度30℃；进样量10μl。
(三)固定化酶活回收率(％)＝[固定化酶活力/加入酶总活力]×100％
实施例一：以磁性fe3o4-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法1
(1)果糖基转移酶的制备：将黑曲霉在30l的中型发酵罐内发酵48h，抽滤收集湿菌体，再用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液清洗，重复三次，所得菌体用上述缓冲液制成菌体悬浮液，经胶体磨破碎菌体，冷冻离心后取上清液，即果糖基转移酶的粗酶液；粗酶液采用超滤浓缩后，测得粗酶液酶活力为102u/ml。
(2)磁性fe3o4-菊粉微球的制备：配制20mg/ml菊粉100ml，加入0.1molfecl2和0.2molfecl3，在室温下剧烈搅拌，随后逐滴加入nh4oh溶液直至ph升高到10，反应1h后，溶液在80℃加热30min，过滤，用乙醇、去离子水反复洗涤至产品呈中性，冷冻真空干燥，得到磁性fe3o4-菊粉微球。
(3)磁性fe3o4-菊粉微球固定化果糖基转移酶：取0.5g磁性fe3o4-菊粉微球加入0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中充分浸泡溶胀，5h后进行磁分离，加入1ml总酶活为102u的果糖基转移酶，在ph5.0-7.0、20-25℃的条件下，以100-200rpm的转速在恒温摇床中振荡固定。4-8h反应后取出，放入4℃冰箱中静置过夜，固定化完成后通过磁场进行分离，沉淀用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活力，即得到固定化酶。测得固定化酶酶活为126.65u/g载体，酶活回收率为62.08％。
实施例二：以磁性fe3o4-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法2
(1)果糖基转移酶的制备：将黑曲霉在30l的中型发酵罐内发酵24h，抽滤收集湿菌体，再用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液清洗，重复三次，所得菌体用上述缓冲液制成菌体悬浮液，经高压均质机破碎菌体，冷冻离心后取上清液，经超滤浓缩后得粗酶液，果糖基转移酶酶活为188u/ml。
(2)磁性fe3o4-果聚糖微球的制备：配制20mg/ml果聚糖溶液100ml，加入0.1molfecl2和0.2molfecl3，在室温下剧烈搅拌，随后逐滴加入nh4oh溶液直至ph升高到10，反应1h后，溶液在80℃加热30min，过滤，用乙醇、去离子水反复洗涤至产品呈中性，冷冻真空干燥，得到磁性fe3o4-果聚糖微球。
(3)磁性fe3o4-果聚糖微球固定化果糖基转移酶：取0.5g磁性fe3o4-果聚糖微球加入0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中充分浸泡溶胀，5h后进行磁分离，加入1ml总酶活为188u的果糖基转移酶，在ph5.0-7.0、20-25℃的条件下，以100-200rpm的转速在恒温摇床中振荡固定。4-8h反应后取出，放入4℃冰箱中静置过夜，固定化完成后通过磁场进行分离，沉淀用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活力，即得到固定化酶。测得固定化酶酶活为297.36u/g载体，酶活回收率为79.08％。
实施例3：磁性fe3o4-果聚糖微球固定化酶的操作稳定性:
取50ml底物溶液于恒温夹套酶反应器中，加入0.1g固定化酶，50℃恒温搅拌反应60min，反应结束后利用磁场快速将产物和固定化酶分开，回收固定化酶，用缓冲液洗涤三次，进行下一批反应，重复操作6次，比较酶活力的变化。6次酶活分别是297.36u/g载体、281.15u/g载体、269.54u/g载体、256.23u/g载体、247.74u/g载体、240.89u/g载体。
实施例4:以磁性fe3o4-菊粉微球为载体固定化酶对低/高温的耐受性
(1)30℃下果糖基转移酶的酶活测定
用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液配制浓度为10％(w/v)的蔗糖溶液，取50ml底物溶液于恒温夹套酶反应器中，加入0.1g固定化酶，30℃恒温搅拌反应60min，于沸水中煮沸10min终止反应。测定酶活。酶活为253.27u/g载体。
(2)70℃固定化酶的酶活测定
用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液配制浓度为10％(w/v)的蔗糖溶液，取50ml底物溶液于恒温夹套酶反应器中，加入0.1g固定化酶，70℃恒温搅拌反应60min，反应结束后利用磁场快速将产物和固定化酶分开。测定酶活。酶活为258.65u/g载体。
实施例5：以磁性fe3o4-菊粉微球为载体固定化酶对低/高ph的耐受性
(1)ph3条件下果糖基转移酶的酶活测定
用0.1mol/l、ph3的柠檬酸-磷酸缓冲液配制浓度为10％(w/v)的蔗糖溶液，取50ml底物溶液于恒温夹套酶反应器中，加入0.1g固定化酶，50℃恒温搅拌反应60min，于沸水中煮沸10min终止反应。测定酶活。酶活为243.24u/g载体。
(2)ph8条件下固定化酶的酶活测定
用0.1mol/l、ph8的柠檬酸-磷酸缓冲液配制浓度为10％(w/v)的蔗糖溶液，取50ml底物溶液于恒温夹套酶反应器中，加入0.1g固定化酶，50℃恒温搅拌反应60min，反应结束后利用磁场快速将产物和固定化酶分开。测定酶活。酶活为241.09u/g载体。
对比例1：以不添加果聚糖或菊粉等多糖的磁性fe3o4微球为载体固定化果糖基转移酶
(1)果糖基转移酶的制备：将黑曲霉在30l的中型发酵罐内发酵48h，抽滤收集湿菌体，再用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液清洗，重复三次，所得菌体用上述缓冲液制成菌体悬浮液，经胶体磨破碎菌体，冷冻离心后取上清液，经超滤浓缩后制得粗酶液。
(2)磁性fe3o4微球的制备：准备一份100ml蒸馏水，加入0.1molfecl2和0.2molfecl3，在室温下剧烈搅拌，随后逐滴加入nh4oh溶液直至ph升高到10，反应1h后，溶液在80℃加热30min，过滤，用乙醇、去离子水反复洗涤至产品呈中性，冷冻真空干燥，得到磁性fe3o4微球。
(3)磁性fe3o4微球固定化果糖基转移酶：取0.5g磁性fe3o4微球加入0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中充分浸泡溶胀，5h后进行磁分离，加入1ml总酶活为102u的果糖基转移酶，在ph5.0-7.0、20-25℃的条件下，以100-200rpm的转速在恒温摇床中振荡固定。4-8h反应后取出，放入4℃冰箱中静置过夜，固定化完成后通过磁场进行分离，沉淀用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活力，即得到固定化酶。测得固定化酶酶活为45.77u/g载体，酶活回收率为24.37％。
对比例2：仅改变以磁性fe3o4-菊粉微球为载体固定化果糖基转移酶的添加量，其他条件与实施例1一致
(1)果糖基转移酶的制备：将黑曲霉在30l的中型发酵罐内发酵48h，抽滤收集湿菌体，再用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液清洗，重复三次，所得菌体用上述缓冲液制成菌体悬浮液，经胶体磨破碎菌体，冷冻离心后取上清液，采用超滤浓缩后制得粗酶液，测得初始果糖基转移酶酶活为102u/ml。
(2)磁性fe3o4-菊粉微球的制备：配制20mg/ml菊粉100ml，加入0.1molfecl2和0.2molfecl3，在室温下剧烈搅拌，随后逐滴加入nh4oh溶液直至ph升高到10，反应1h后，溶液在80℃加热30min，过滤，用乙醇、去离子水反复洗涤至产品呈中性，冷冻真空干燥，得到磁性fe3o4-菊粉微球。
(3)磁性fe3o4-菊粉微球固定化果糖基转移酶：取0.5g磁性fe3o4-菊粉微球加入0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中充分浸泡溶胀，5h后进行磁分离，加入总酶活分别为51u、102u、153u、204u、255u、306u的果糖基转移酶，在ph5.0-7.0、20-25℃的条件下，以100-200rpm的转速在恒温摇床中振荡固定。4-8h反应后取出，放入4℃冰箱中静置过夜，固定化完成后通过磁场进行分离，沉淀用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活力，即得到固定化酶。测得固定化酶酶活为56.97u/g载体、126.65u/g载体、210.04u/g载体、306.32u/g载体、354.28u/g载体、413.42u/g载体，酶活回收率为55.85％、62.08％、68.64％、75.08％、69.48％、67.5％。
对比例3：仅改变以磁性fe3o4-果聚糖微球为载体固定化果糖基转移酶的添加量，其他条件与实施例2一致
(1)果糖基转移酶的制备：将黑曲霉在30l的中型发酵罐内发酵24h，抽滤收集湿菌体，再用0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液清洗，重复三次，所得菌体用上述缓冲液制成菌体悬浮液，经高压均质机破碎菌体，冷冻离心后取上清液，经超滤浓缩后得粗酶液，果糖基转移酶酶活为188u/ml。
(2)磁性fe3o4-果聚糖微球的制备：配制20mg/ml菊粉100ml，加入0.1molfecl2和0.2molfecl3，在室温下剧烈搅拌，随后逐滴加入nh4oh溶液直至ph升高到10，反应1h后，溶液在80℃加热30min，过滤，用乙醇、去离子水反复洗涤至产品呈中性，冷冻真空干燥，得到磁性fe3o4-果聚糖微球。
(3)磁性fe3o4-果聚糖微球固定化果糖基转移酶：取0.5g磁性fe3o4-果聚糖微球加入0.1mol/l、ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中充分浸泡溶胀，5h后进行磁分离，加入1ml总酶活分别为51u、102u、153u、204u、255u、306u的果糖基转移酶，在ph5.0-7.0、20-25℃的条件下，以100-200rpm的转速在恒温摇床中振荡固定。4-8h反应后取出，放入4℃冰箱中静置过夜，固定化完成后通过磁场进行分离，沉淀用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活力，即得到固定化酶。测得固定化酶酶活为55.11u/g载体、123.25u/g载体、210.23u/g载体、310.54u/g载体、350.75u/g载体、410.32u/g载体，酶活回收率为54.03％、60.42％、68.7％、76.11％、68.77％、67.05％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。