本发明涉及一种高虾青素产量的菌株及其应用。
背景技术：
虾青素(astaxanthin)等含氧酮基类胡萝卜素具有抗氧化性能，能够清除体内自由基、延缓衰老。虾青素是一种呈红色的色素，主要在海洋生物体内积累，如，虾、螃蟹、鲑鱼等，在植物界中，虾青素主要存在于蓝细菌、地衣和藻类中，在高等植物中，仅存在与少数植物的花瓣中。虾青素具有超强的抗氧化能力和诸多生物活性，以及这种色素的艳丽红色使得它具有广泛的应用价值和市场潜力。虾青素主要应用于养殖业、食品、保健品和医药等工业。目前虾青素最大的市场是水厂养殖业和家畜养殖业，主要用作鱼类(如鲑鱼、鲟鱼、虹鳟鱼等)、虾蟹等甲壳类动物及家禽的饲料添加剂。虾青素具有良好的着色能力和增强动物免疫功能，并且对他们的生长繁殖也有很重要的作用，虾青素可促进鱼卵受精、减少胚胎发育的死亡率，促进个体生长、增加成熟速度和繁殖力。
虾青素的生产方法主要包括化学法合成法，甲壳类动物废物提取、藻类生物合成、细菌合成、真菌合成、植物基因改造等。然而化学合成虾青素的过程中可能被其他有害物质污染，产品中还含有天然的异构体。由于人们环保意识的增强，化学合成品的使用不仅为广大消费者所警惕，也更为各国法规所限制。并且，化学合成方法得到的虾青素大多数为顺式结构，在养殖物体内不能转化成天然的反式构型，因此，养殖物对化学合成的虾青素吸收能力较弱，利用率仅为40％左右。与天然虾青素相比，化学合成虾青素着色能力和生物效价低得多，因此推广应用受到限制。法夫酵母由于其生产迅速、虾青素产量高等优点，已成为天然虾青素生产的研究热点。
但是，法夫酵母菌株的发酵温度一般为18～22℃，温度较低，菌株的产量有限，而且易于退化是的其工业化生产受到限制。因此必须进行高产菌株选育和菌种改良，以期获得高产虾青素、耐高温发酵的优良菌种。另外，法夫酵母虾青素发酵条件对虾青素的产量也有着重要的影响，因此优化发酵条件也是非常必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高虾青素产量的菌株及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种高虾青素产量的菌株，构建方法包括以下步骤：
1)通过转基因技术将adketo1(seqidno.1)和adketo2(seqidno.2)连接到克隆载体上，得到表达载体；
2)将表达载体通过电击转化转入目的菌株中；
3)使用复合酶抑制剂，采用多轮递推法对转化子进行筛选，得到目标菌株。
进一步地，目的菌株为红法夫酵母。
进一步地，复合酶抑制剂选自葡萄糖结构类似物、甾醇类合成抑制剂、呼吸链抑制剂中的一种。
优选地，复合酶抑制剂选自抗霉素a、β～紫罗兰酮、二苯胺中的一种。
进一步地，电击转化的条件设定为：电压4～6kv/cm，以25～75mmol/l浓度的dtt处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.6～0.8μg/μl。
优选地，电击转化的条件设定为：电压5kv/cm，以50mmol/l浓度的dtt处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.7μg/μl。
一种虾青素生产方法，使用上述的高虾青素产量的菌株发酵制备。
进一步地，培养基中含有麦芽汁提取物和h2o2。
进一步地，培养基中含有3～7g/l麦芽汁提取物和2～6mmol/lh2o2。
优选地，培养基中含有6g/l麦芽汁提取物和5mmol/lh2o2。
进一步地，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为4～10l/h。
优选地，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为6l/h。
进一步地，发酵过程中，还需要提供光照，光强为400～800lux。
优选地，发酵过程中，还需要提供光照，光强为650lux。
本发明的有益效果是：以微生物红发夫酵母发酵生产天然虾青素。发酵生产得到的虾青素为自由态，98％为右旋光结构，并以反式结构为主，动物吸收率可达98％，沉积效果好。本发明的方法能够提高微生物源天然虾青素的生产效率，优化生产工艺，降低生产成本，可用于实现微生物源天然虾青素的较大规模生产。
具体实施方式
一种高虾青素产量的菌株，构建方法包括以下步骤：
1)通过转基因技术将adketo1(seqidno.1)和adketo2(seqidno.2)连接到克隆载体上，得到表达载体；
2)将表达载体通过电击转化转入目的菌株中；
3)使用复合酶抑制剂，采用多轮递推法对转化子进行筛选，得到目标菌株。
进一步地，目的菌株为红法夫酵母。
进一步地，复合酶抑制剂选自葡萄糖结构类似物、甾醇类合成抑制剂、呼吸链抑制剂中的一种。
优选地，复合酶抑制剂选自抗霉素a、β～紫罗兰酮、二苯胺中的一种。
进一步地，电击转化的条件设定为：电压4～6kv/cm，以25～75mmol/l浓度的dtt处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.6～0.8μg/μl。
优选地，电击转化的条件设定为：电压5kv/cm，以50mmol/l浓度的dtt处理处于对数生产期的红法夫酵母，质粒浓度为0.7μg/μl。
一种虾青素生产方法，使用上述的高虾青素产量的菌株发酵制备。
进一步地，培养基中含有麦芽汁提取物和h2o2。
进一步地，培养基中含有3～7g/l麦芽汁提取物和2～6mmol/lh2o2。
优选地，培养基中含有6g/l麦芽汁提取物和5mmol/lh2o2。
进一步地，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为4～10l/h。
优选地，发酵过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为6l/h。
进一步地，发酵过程中，还需要提供光照，光强为400～800lux。
优选地，发酵过程中，还需要提供光照，光强为650lux。
下面结合具体实验对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
1.引物设计
根据genbank中获得adketo1和adketo2的序列，设计上下游引物。
2.构建质粒
将设计好的上下游引物作为引物，以夏侧金盏花的基因组为模板扩增获得外源基因adketo1和adketo2的全长，再利用重组酶将外源基因和载体连接，形成重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，对转化子进行鉴定，再将鉴定成功的转化子摇瓶培养后，提取质粒进行测序。
pcr扩增基因反应过程如下表：
3.重组质粒转化
将测序成功的质粒电击转入红发夫酵母细胞中，对转化子进行鉴定，再将鉴定成功的转化子摇瓶培养后，提取质粒进行测序。
4.菌株筛选
将测序成功的重组菌株进行复合酶抑制剂多轮递推筛选。虾青素筛选中用到的复合酶抑制剂主要有葡萄糖结构类似物、甾醇类合成抑制剂和呼吸链抑制剂，应用效果较好的有抗霉素a、β-紫罗兰酮、二苯胺等。
使用上述的几种复合抑制剂，采用多轮递推进行筛选，选育生长速度较快且虾青素含量更高的菌株，最终筛选到的目标菌株中虾青素含量为出发菌株的13.11倍。
5.发酵
a.培养基
斜面培养基(g/l)葡萄糖20，酵母粉3，蛋白胨5，麦芽汁3，琼脂20，ph5。
液体种子培养基(g/l)葡萄糖20，酵母粉3，蛋白胨5，麦芽汁3，ph5。
发酵培养基(g/l)混合碳源(葡萄糖、蔗糖以质量比4:1混合)30，混合氮源(蛋白胨、(nh4)2so4)7，mgso4·7h2o1.5，(nh4)3c6h5o72，na2hpo42，麦芽汁提取物7，5mmol/lh2o2，ph5。
b.培养方法
a)菌种保藏
(1)菌种接入斜面培养基，20℃培养48h，4℃保藏，每月传代1次；
(2)20℃培养48h，离心后加入无菌新鲜培养基和甘油，甘油浓度10％～20％，-70～-80℃低温冷冻保藏。
b)种子培养
将一环菌苔(20℃培养3～4d的斜面种)接种与250ml的锥形瓶，20℃、150r/min的恒温摇床培养48h。
c)摇瓶培养
250ml锥形瓶中装30ml培养基，灭菌后以8％的接种量接入培养48h的种子液，20℃、150r/min摇床培养。
d)生物反应器培养
反应器和培养基灭菌后以8％的接种量接入培养48h的种子液，控制通气和搅拌，按照一定的方式补料，并定时取样测定数据，培养过程中维持温度为20℃，培养液ph为5。培养过程中，还需要充添氧气到培养基中，充氧量为6l/h，并提供光强为650lux的光照。
6.虾青素的提取
取培养基，离心分离洗涤3次，加3mol/lhcl，沸水浴3min，迅速冷却，离心分离洗涤2次，加入甲醇震荡提取1min，离心取上清液。如果提取不完全，再加甲醇提取，直至菌体无色。
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<110>广州立达尔生物科技股份有限公司
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