用于单细胞RNA测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法与流程

本发明涉及一种用于单细胞rna测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法。

背景技术：

雌性绵羊早在胚胎时期，卵原细胞就已陆续分化而产生了初级卵母细胞；在绵羊性成熟前，初级卵母细胞一直停留在第一次减数分裂的前期ⅰ时期而不再生长发育。直到绵羊进入性成熟期，初级卵母细胞受到性激素刺激后才逐渐苏醒，并在每一个发情期内重新继续生长发育和分裂。

在绵羊繁殖研究中，由于不同品种绵羊卵巢的调节机制差异，导致存在着季节性发情和常年发情的区别；且一个情期内绵羊卵巢中有时仅排出单个卵母细胞，有时排出多个卵母细胞，进而造成单羔和多羔的现象。多种排卵现象集中于绵羊一个物种之中，绵羊因此可作为一种研究卵巢排卵机制差异的优秀模式动物。

近年来，随着二代高通量测序技术的兴起，不少学者为研究绵羊的排卵机制差异，都采取将整个绵羊卵巢进行rna提取后送样测序。测序所获得的结果比较差强人意，究其原因主要在于采样方案不够精细化，未能使得所采集的样品处于单一因素条件下比较。

卵巢中除了有着丰富的静脉、动脉微血管、淋巴管和神经丛外，还有着卵巢冠、囊状附件、卵巢旁体、结缔组织、卵泡膜、颗粒细胞和各级卵母细胞等，目前所采取的整个卵巢研磨提取rna后的测序办法，首先未能筛选出关键致因基因的表达量差异，其次若能筛选出一些潜在基因也不能从空间上很好的定位识别。事实上，绵羊卵母细胞发育及排卵机制主要与卵母细胞自身和其周围的卵丘颗粒细胞相关联。为满足试验研究可操作性要求，实施同期发情后可统一采样。由于rna表达的时空特异性特点，故在理想条件下应严格控制采样的时间和空间位置，保持采样的严谨性，在此条件下通过二代测序筛选出来的差异表达基因才能更为精确，这也是未来rna测序的采样趋势。

目前，研究者们主要采样绵羊整个卵巢进行转录组学研究，所获得的数据是整个卵巢中所有组织和细胞的基因表达信息。而很多情况下，研究者们仅关注排卵前的大卵泡组织内的基因表达情况，但该组织只占卵巢很小的一部分，在转录组测序过程中很容易被整个卵巢的表达信息所掩盖。此外，绵羊屠宰后，卵巢上的各级卵泡均有分布，即使是排卵期大卵泡也由卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞等组成，且判断卵泡是否为排卵前大卵泡对于繁殖研究至关重要，而目前尚无统一规定的判断标准。

因此，建立一套更为精准的用于rna(或单细胞rna)测序的绵羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞的采集方法显得尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于单细胞rna测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种用于单细胞rna测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法,包括以下步骤：

(1)从屠宰场获取新鲜的母羊(绵羊)卵巢，经消毒后，选择直径大于3mm的单个卵泡，用装有预热dpbs缓冲液的注射器抽取卵泡液，得到卵泡液-dpbs液；

(2)去掉注射器针头，将卵泡液-dpbs液从注射器推出至培养皿中，将装有卵泡液-dpbs液的培养皿放置于热台上，在体视镜下观察，选取卵丘颗粒细胞包裹较好的cocs；

(3)用口吸管将cocs转移至装有预热透明质酸酶溶液的培养皿中，然后用移液器反复吹打，直至在体视镜下观察到卵丘颗粒细胞全部脱尽，卵母细胞裸露出透明带为止；裸露的卵母细胞通过口吸管转移至预热的dpbs缓冲液中清洗，余下的溶液用于提取卵丘颗粒细胞；

(4)用口吸管将步骤(3)中经dpbs缓冲液清洗后的卵母细胞转移至预热的链霉蛋白酶溶液液滴中作用一段时间，在体视镜下观察，直至可见透明带变形，但尚未开始消融，立即将卵母细胞通过口吸管转移至预热的dpbs缓冲液中清洗，进行后续细胞裂解及rna提取操作；

(5)步骤(3)中余下的溶液经离心，弃上清，收集卵丘颗粒细胞沉淀，加入预热的dpbs缓冲液重悬，然后进行细胞裂解及rna提取操作。

优选地，步骤(1)所用注射器配有21g针头。更优选10ml注射器配21g针头。

本发明中所述透明质酸酶溶液的配制方法为：100mg透明质酸酶粉剂溶于5-10mldpbs缓冲液中，配成储存液(储存液可于-20℃保存)，储存液用dpbs缓冲液稀释10-20倍后作为工作液。

本发明中所述链霉蛋白酶溶液的配制方法为：100mg链霉蛋白酶粉剂溶于10-20mldpbs缓冲液中，即得。保存条件为-20℃。

优选地，步骤(5)中离心条件为：30-38℃，2000rpm离心5分钟。离心前，将离心管(1.5ml)放置于离心机中，应统一将管的合口朝向离心机中心轴。离心后，用200μl枪头贴近管合口一侧，将上清液体部分全部吸出，避免将沉淀一侧的卵丘颗粒细胞吸走或悬浮。

优选地，步骤(1)中消毒的具体方法如下：将卵巢浸泡在30-38℃(优选35℃)的无菌生理盐水中清洗，其中所述无菌生理盐水中含有0.065-0.1mg/ml的青霉素和0.05-0.1mg/ml的链霉素(优选青霉素、链霉素各0.1mg/ml)。

前述的方法，步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)中所述预热是指30-38℃(优选38℃)，步骤(2)所述热台的温度为30-38℃(优选38℃)。

前述的方法，步骤(2)中体视镜下所选取cocs(卵丘细胞群)的外观形态应为：卵母细胞被大量卵丘颗粒细胞所包裹，整体呈积云状。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明采用羊卵母细胞、卵丘颗粒细胞分别收集，可保证采样空间上的统一，无需整个卵巢研磨。收集后的卵母细胞和卵丘颗粒细胞可直接用于rna提取或各种转录组高通量测序。与现有的采样绵羊整个卵巢进行rna提取比较基因表达的方法相比，本发明的最大特点在于采样时空精准，可进一步提高卵巢采样用于分子试验的精确性。

(一)卵泡液抽取所使用的注射器为10ml注射器，配注射器针头为21g。若针头型号过小(针头太细)，容易使整个cocs(卵丘细胞群)中卵母细胞与其周围的卵丘颗粒细胞发生脱离，无法判定卵母细胞质量。若针头型号过大则会导致cocs丢失。

(二)各步骤中使用的dpbs、透明质酸酶、链霉蛋白酶等均需在30-38℃下预热充分，并在作用细胞时一直处于30-38℃热台上。若温度过低，容易导致cocs与卵泡液内多余的颗粒细胞产生黏连。若温度过高，则会破坏cocs的生理活性。

(三)在体视镜下应选取卵母细胞被大量卵丘颗粒细胞所包裹的cocs，外观最好呈积云状。若选取了外观不是积云状的cocs，则难以获得足够多的卵丘颗粒细胞。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中实验室内捡取、分离及收集卵母细胞和卵丘颗粒细胞的操作流程图。

图2为本发明较佳实施例中在体视镜下卵母细胞及卵丘颗粒细胞的状态。

图3为本发明较佳实施例中利用安捷伦2100检测单细胞阳性扩增的结果峰图，图中所示其扩增的阳性样品的主峰位于2000bp左右，在数百片段内没有过多的小片段降解现象，即显示采样、扩增成功。

图4为本发明较佳实施例中利用安捷伦2100检测单个卵母细胞扩增的结果峰图，图中所示其扩增的单个卵母细胞的主峰位于1000-2000bp之间，在数百片段内没有过多的小片段降解现象，故本方法的采样、扩增成功，可以用于后续单细胞转录组测序。

图5为本发明较佳实施例中利用安捷伦2100检测数百个卵丘颗粒细胞扩增的结果峰图，图中所示其扩增的主峰位于2000bp左右，在数百片段内没有过多的小片段降解现象，故本方法的采样、扩增成功，可以用于后续单细胞转录组测序。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中透明质酸酶溶液的配制方法如下：100mg透明质酸酶粉剂溶于10mldpbs缓冲液中，配成储存液分装-20℃保存，储存液稀释10倍后可作为工作液。

链霉蛋白酶溶液的配制方法如下：100mg链霉蛋白酶粉剂溶于20mldpbs缓冲液中，配成0.5％浓度，经滤器过滤后，既是储存液也是工作液，分装，保存于-20℃。

实施例1用于单细胞rna测序的羊卵母细胞和卵丘颗粒细胞采集方法

一、屠宰场新鲜卵巢的获得及卵泡液抽取

(1)从屠宰场获取新鲜离体的绵羊卵巢，迅速通过35℃的无菌生理盐水(添加青霉素、链霉素各0.1mg/ml)运输至实验室；选择直径大于3mm的大卵泡，用装有38℃预热dpbs的注射器抽取其卵泡液。

(2)将吸有卵泡液的注射器，去掉注射器针头，将卵泡液-dpbs液体推出注射器至3.5cm的培养皿中。

上述所使用注射器抽卵效果较好的是用10ml注射器配21g针头。

二、体式镜下分离并收集卵母细胞和卵丘颗粒细胞

(1)体式镜下分离并收集卵母细胞和卵丘颗粒细胞的具体操作流程如图1所示：

将装有卵泡液-dpbs液体的培养皿放置于热台上、体视镜下，选取卵丘颗粒细胞包裹较好的cocs(卵丘细胞群)，所选取的cocs外观最好呈积云状，如图2a所示；cocs通过口吸管将其转移至新的培养皿中(该培养皿预先装有38℃预热的透明质酸酶400μl)；

(2)在透明质酸酶中，用移液器反复吹打约200次至在体视镜下可观察到卵丘颗粒细胞全部脱尽、卵母细胞裸露出透明带为止，将裸露的卵母细胞在400μldpbs中简单清洗后，如图2b所示；

(3)再将裸露的卵母细胞通过口吸管捡出至新的链霉蛋白酶液滴中(38℃预热)，38℃作用5分钟左右即可看见透明带变形，随后便开始消融，如图2c所示；

(4)链霉蛋白酶作用约5分钟后，此时只要观察到卵母细胞透明带变形，未等待其消融，就需立即将卵母细胞通过口吸管转移至新的dpbs液滴(38℃预热)中简单润洗，立即通过口吸管在4μl体积内将其转移至800μl的trizol中，随后直接置于液氮保存运输，实际操作中当以图2c中的卵母细胞状态为最佳状态，图2d为链霉蛋白酶作用时间过长的结果；

(5)步骤(3)中，其剩下的透明质酸酶液体中分布着约10000个卵丘颗粒细胞可供卵丘颗粒细胞采集，可用移液器将100μl透明质酸酶液体转移新的1.5ml离心管中，2000rpm离心5分钟后，将上清液吸出，保留管内沉淀的卵丘颗粒细胞；该过程中，离心前的1.5ml离心管放置于离心机中应统一将管的合口朝向离心机中心轴，离心后用黄枪头贴近管合口一侧，将上清液体部分全部吸出，避免将沉淀一侧的卵丘颗粒细胞吸走或悬浮；

(6)向1.5ml离心管中的细胞沉淀加入约50μl的38℃预热的dpbs，利用移液器配200μl枪头反复吹打数次至重悬；

(7)从卵丘颗粒细胞的dpbs重悬液中吸取10μl，在体视镜下观察有无悬浮细胞(亮晶晶的球体)，如果有即可再吸取约4μl直接加入800μl的trizol裂解液中，之后立即进入液氮运输保存。

步骤(5)中剩余的300μl透明质酸酶液体可经过2000rpm离心5分钟后，将液体部分吸出，保留管内沉淀的颗粒细胞，此时加入trizol裂解液，也可以提取微量rna进行相应测序。

三、卵母细胞和卵丘颗粒细胞的检测

通过smart-seq2试剂盒对目的细胞rna信号进行扩增放大，获得目的细胞cdna文库。然后，吸取1μl扩增后产生的cdna文库，使用安捷伦2100仪器进行文库质检。

图3是利用安捷伦2100检测单细胞阳性扩增的结果峰图，图中所示其扩增的阳性样品的主峰位于2000bp左右，在数百片段内没有过多的小片段降解现象，即显示采样、扩增成功。

图4是利用安捷伦2100检测单个卵母细胞扩增的结果峰图，图中所示其扩增的单个卵母细胞的主峰位于1400-1700bp之间，在数百片段内没有过多的小片段降解现象，故本方法的采样、扩增成功，可以用于后续单细胞转录组测序。

图5是利用安捷伦2100检测数百个卵丘颗粒细胞扩增的结果峰图，图中所示其扩增的主峰位于2000-3000bp之间，在数百片段内没有过多的小片段降解现象，故本方法的采样、扩增成功，可以用于后续单细胞转录组测序。

以上仅为本发明的一个优选实例，对于从屠宰场获得的新鲜卵巢可以根据研究目的任选一个或多个卵泡直径进行采样，可动态或设立组别来进行卵巢排卵机制比较研究。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。