一种提高谷氨酸发酵中后期转化率的方法与流程

本发明属于谷氨酸生产
技术领域：
，涉及一种提高谷氨酸发酵中后期转化率的方法。
背景技术：
：谷氨酸，是一种酸性氨基酸。分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。谷氨酸是里索逊1856年发现的，为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。目前，制备谷氨酸最常用的方法是微生物发酵法。谷氨酸棒杆菌是谷氨酸发酵的菌株，属于兼性好氧菌，培养基成分及培养条件不同，产物也不同。在谷氨酸发酵过程中，当培养基中碳氮比的改变会影响菌株增殖和谷氨酸合成。当发酵液ph呈酸性时，生成的谷氨酸会进一步转化为乙酰谷氨酰胺。因此，谷氨酸发酵条件优化主要为培养基组分和发酵过程参数控制优化两方面。在发酵过程中，菌种自身的发酵特性有时会发生变化，导致批次间发酵性能出现巨大差异。一旦菌种发酵特性发生改变，菌体对环境变化的适应能力和产酸能力就会下降，表现为补料之后出现“只耗糖、不产酸”的现象，最终谷氨酸浓度很低，造成发酵性能不稳定。谷氨酸发酵的前期主要菌株增殖迅速，中后期菌株增殖速度放缓，但是谷氨酸合成加快，是合成分泌谷氨酸的关键时期。微生物在不同的环境条件下、利用不同底物代谢途径是不同的，有目的地对细胞代谢途径进行修饰和改造，改变细胞原有的代谢特征，可以提高目标产物的产量和得率。当四碳二羧酸全部由co2固定反应供给时，最高理论糖酸转化率为81%；而当co2固定反应完全不起作用，四碳二羧酸只能通过乙醛酸供给，最高理论转化率为54%。谷氨酸生产工艺已经发展相对成熟，主要技术指标为谷氨酸浓度10%-12%，糖酸转化率55%-60%。但是，与国外先进发酵工艺相比较，仍有较大的提升空间。有效地提高转化率，将可以节省原料成本、提升谷氨酸发酵的经济效益。利用谷氨酸棒杆菌进行谷氨酸发酵时的代谢副产物并不多，最主要的副产物是co2。因此，强化谷氨酸棒杆菌代谢途径中的co2固定反应，并为此让谷氨酸合成关键酶系有效地、相互协同作用，将有望提高co2的回用率和糖酸转化率，节省原料成本、增加企业利润。谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能上的特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透，即完成由谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。这样，由于终产物谷氨酸不断地排出细胞外，使细胞内的谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，谷氨酸就会在细胞内继续不断地被优先合成，又不断地透过细胞膜，分泌到发酵培养基中，从而得以大量积累。调整细胞膜通透性的物质较多，不同的菌株之间细胞膜结构差异较大，因此并没有规律可循，选择合适的调节剂来调整细胞膜的通透性也是谷氨酸发酵工艺中需要解决的技术问题。技术实现要素：为了克服现有技术菌株发酵转化率和谷氨酸产量低等缺陷，本发明提出了一种提高谷氨酸发酵中后期转化率的方法。本发明是通过如下技术方案来实现的：一种提高谷氨酸发酵中后期转化率的方法，其包括如下步骤：在发酵过程中添加肌醇和二甲基甲酰胺，并且采用超声波处理。具体地，所述方法包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌接种到种子培养基中，在32℃，100rpm摇床培养12-24h，得到的谷氨酸棒杆菌种子液；将种子液以8-10％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵时间为48h；发酵时间分为两个阶段，第一阶段为12h，发酵温度为32℃，通气量为0.3-0.5vvm；第二阶段为36h，发酵温度为32℃，通气量为0.4-0.6vvm，第二阶段开始时，往发酵培养基中添加肌醇和二甲基甲酰胺，添加量分别为0.6-0.8%和0.3-0.4%，同时超声处理，超声频率为28khz、超声功率密度为100w/l、超声处理时间为1h；整个发酵过程中，通过自动流加氨水控制ph在5.0，并通过流加浓度为100g/l的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％；第二阶段完成后，收集发酵液。优选地，所述肌醇的添加量为0.6-0.8%。优选地，所述二甲基甲酰胺的添加量为0.3-0.4%。优选地，所述超声处理的参数为：超声频率为28khz、超声功率密度为100w/l、超声处理时间为1h。优选地，所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比)：葡萄糖6％、玉米浆3％、磷酸二氢钾0.2％、七水硫酸镁0.02％、一水硫酸锰0.01％，115℃灭菌15min；优选地，所述发酵罐培养基的组分为（质量百分比）：葡萄糖12%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸亚铁0.02%、七水硫酸镁0.02%。与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：实现各营养元素的合理配比，最大发挥菌体的产酸能力，以提高发酵转化率和产酸；谷氨酸产生菌增殖到最大值，谷氨酸生成酶系形成完全时，适当时机加入适量的肌醇和二甲基甲酰胺，既可以强化co2固定反应,削弱乙醛酸循环,保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给α-酮戊二酸，通过还原氨基化反应，大量积累谷氨酸，提高发酵转化率，还能够促进细胞膜通透性的增强，有利于底物分子更容易进入细胞与生物酶接触，也有利于谷氨酸分泌到胞外，既提高了转化率，又增加了谷氨酸产量。超声波生物作用机制主要是空化作用引起的机械力和热作用，该作用可能导致空泡周围的细胞的细胞壁和质膜的击穿或可逆的质膜透性改变，这种改变是可逆的，细胞自身能修复壁和膜的破损则可以提高细胞膜和细胞壁穿透性，并且不影响细胞的生物活性，因而超声对细胞膜的作用是暂时的，当超声作用终止后,细胞膜的通透性就会恢复到原来的状态；但是过高强度的超声波会造成菌株破裂死亡，因此本发明选择频率28khz、功率密度100w/l超声处理1h。本发明开拓性地将co2固定和细胞通透衔接到一起，结合低强度的超声波处理，大幅提高了转化率和谷氨酸产量。附图说明图1：不同添加量的肌醇对转化率和谷氨酸浓度的影响；图2：不同添加量的二甲基甲酰胺对转化率和谷氨酸浓度的影响。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。实施例1一种提高谷氨酸发酵中后期转化率的方法，其包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13761接种到种子培养基中，在32℃，100rpm摇床培养12h，得到的谷氨酸棒杆菌种子液；所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比)：葡萄糖6％、玉米浆3％、磷酸二氢钾0.2％、七水硫酸镁0.02％、一水硫酸锰0.01％，115℃灭菌15min；将种子液以8％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵时间为48h；发酵时间分为两个阶段，第一阶段为12h，发酵温度为32℃，通气量为0.3vvm；第二阶段为36h，发酵温度为32℃，通气量为0.4vvm，第二阶段开始时，往发酵培养基中添加肌醇和二甲基甲酰胺，添加量分别为0.6%和0.3%，同时超声处理，超声频率为28khz、超声功率密度为100w/l、超声处理时间为1h；整个发酵过程中，通过自动流加氨水控制ph在5.0，并通过流加浓度为100g/l的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％；第二阶段完成后，收集发酵液；所述发酵罐培养基的组分为（质量百分比）：葡萄糖12%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸亚铁0.02%、七水硫酸镁0.02%。实施例2一种提高谷氨酸发酵中后期转化率的方法，其包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13761接种到种子培养基中，在32℃，100rpm摇床培养24h，得到的谷氨酸棒杆菌种子液；所述谷氨酸棒杆菌种子培养基的组分为(以下均为质量百分比)：葡萄糖6％、玉米浆3％、磷酸二氢钾0.2％、七水硫酸镁0.02％、一水硫酸锰0.01％，115℃灭菌15min；将种子液以10％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，发酵时间为48h；发酵时间分为两个阶段，第一阶段为12h，发酵温度为32℃，通气量为0.4vvm；第二阶段为36h，发酵温度为32℃，通气量为0.5vvm，第二阶段开始时，往发酵培养基中添加肌醇和二甲基甲酰胺，添加量分别为0.8%和0.4%，同时超声处理，超声频率为28khz、超声功率密度为100w/l、超声处理时间为1h；整个发酵过程中，通过自动流加氨水控制ph在5.0，并通过流加浓度为100g/l的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％；第二阶段完成后，收集发酵液；所述发酵罐培养基的组分为（质量百分比）：葡萄糖12%、玉米浆3%、尿素0.5%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸亚铁0.02%、七水硫酸镁0.02%。实施例3各因素对转化率和谷氨酸浓度的影响：设置对照组，其中：对照组1：不添加肌醇和二甲基甲酰胺，其余同实施例1；对照组2：不添加肌醇，其余同实施例1；对照组3：不添加二甲基甲酰胺，其余同实施例1；对照组4：不采用超声处理，其余同实施例1；实验组为实施例1。各组转化率和谷氨酸浓度见表1。表1组别转化率谷氨酸浓度对照组148.2110.26对照组253.4311.84对照组355.6811.55对照组457.3612.79实验组62.3713.92结论：通过检测肌醇、二甲基甲酰胺以及超声波三种因素对转化率和谷氨酸浓度的影响发现，三种因素具备较好的协同效果，能够大幅提高转化率和谷氨酸浓度。实施例41.不同添加量的肌醇对转化率和谷氨酸浓度的影响，分别设置添加量为：0，0.2%，0.4%，0.6%，0.8,1.0%，如图1所示，随着肌醇添加量的增加，转化率和谷氨酸浓度逐步提高，当增达到0.6%时，谷氨酸浓度达到最高，继续提高肌醇添加量，谷氨酸浓度没有明显增加，转化率略有提高，当添加量增大到1.0%时，转化率和谷氨酸浓度均有所下降。2.不同添加量的二甲基甲酰胺对转化率和谷氨酸浓度的影响，分别设置添加量为：0.1%，0.2%，0.3%，0.4%,0.5%，0.6%，如图2所示，随着二甲基甲酰胺添加量的增加，转化率和谷氨酸浓度逐步提高，当增达到0.3%时，转化率最高，继续提高二甲基甲酰胺添加量到0.4%，转化率不会增加，但是谷氨酸浓度有少量增加，继续提高二甲基甲酰胺添加量，转化率和谷氨酸浓度均有所下降；本发明还检测了乙醇、甲醇对转化率和谷氨酸浓度的影响，在本实验体系中，低浓度的乙醇或者甲醇（1%以内）对转化率和谷氨酸浓度没有明显影响，提高浓度后，菌株会有一定的死亡率，可能与细胞壁损害程度有关，具体结果附图中未显示。实验分析：细胞生理代谢活力和细胞膜通透性的差异是造成转化率水平不同的重要原因。其中，本发明通过添加适量的二甲基甲酰胺，使得菌体的细胞膜通透性增强，有利于底物分子更容易进入细胞与生物酶接触，进而提高转化率。适量的肌醇可以强化co2固定反应,促进谷氨酸的积累，提高发酵转化率。本发明将co2固定和细胞通透衔接到一起，结合低强度的超声波处理，使得物质的生产和运输相结合，大幅提高了转化率和谷氨酸产量。以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。当前第1页12