一种用于鉴定葡萄花翅小卷蛾的引物对及其应用的制作方法

本发明属于分子鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴定检疫性害虫葡萄花翅小卷蛾的引物对，以及利用该引物对葡萄花翅小卷蛾的分子鉴定方法。

背景技术：

葡萄花翅小卷蛾(lobesiabotrana)属鳞翅目(lepidoptera)，卷蛾科(tortricidae)，花翅小卷蛾属(lobesia)，为严重危害多种经济植物花和果实的世界性害虫，在世界许多国家包括我国被列为重要的进境植物检疫性有害昆虫。该虫原产地为意大利，现已传至全欧洲、非洲北部和西部、亚洲的中东和远东地区以及美国部分地区，目前我国还没有该种发生的相关报道。

该虫一年发生一代至多代，具体代数与光周期和温度等因素有关。其第一代幼虫危害葡萄花芽，第二代以后幼虫危害葡萄果实，产生直接经济损失；葡萄果实受害后，伤口容易被葡萄灰霉病侵染，造成灰霉病流行，造成更大的经济损失。葡萄花翅小卷蛾成虫一般在日落黄昏后开始进行交配、产卵等活动。另外，除葡萄外，葡萄花翅小卷蛾的寄主植物还有苹果、李、柿子、樱桃、猕猴桃、石榴、橄榄等、油桃等四十多种植物，其一旦传入我国水果重要产区，势必多我国水果的生产、销售、出口造成重大影响，从而严重威胁我国水果的安全生产，所以对其进行防控与疫情干预具有重要的意义。

目前，针对葡萄花翅小卷蛾的鉴定采用传统的形态鉴定，在鳞翅目卷蛾科的害虫中，葡萄花翅小卷蛾具有以下的形态特征：成虫体型属于中小型的蛾类昆虫，体长4.5-5.5mm，翅展10-13mm，成虫大小与幼虫取食相关。触角丝状，浅褐色。头部为奶油色，且头顶簇生着灰色细条状毛丛；背部着生着明显的褐色背丛毛(牛春敬等，2013.检疫性有害生物—葡萄花翅小卷蛾[j].检验检疫学刊)。前翅近前缘有凹起的部分，也由突出的部分，顶角突出，边缘具有细毛，全翅具有三块明显的由黑色和浅褐色组成的斑驳状图纹，边缘白色。当成虫静止时，两翅合并呈吊钟状。雌雄成虫的差异主要是外生殖器(李俊峰等，2017.世界性害虫葡萄花翅小卷蛾入侵我国的风险分析[j].生物安全学报)。

形态鉴定法对鉴定者的专业知识和葡萄花翅小卷蛾的样本完整性均要求较高，并且食心虫类易与形态近似种混淆，造成葡萄花翅小卷蛾的鉴定费时费力，且准确度和重复性都不高。传统的形态学方法难以满足口岸检疫以及水果和种苗调运过程中对葡萄花翅小卷蛾快速识别与鉴定的实际需求，尤其当截获的样本为幼虫或残体时，而葡萄花翅小卷蛾的快速准确识别是有效阻止其进一步传播扩散的重要前提。

技术实现要素：

针对葡萄花翅小卷蛾的鉴定方法为形态鉴定，对样本质量和鉴定人员的专业知识要求都很高，适用性低，鉴定难度大，且鉴定结果准确度低的上述问题，本发明提供葡萄花翅小卷蛾的特异性引物对，以及利用该引物对鉴定葡萄花翅小卷蛾，该方法具有快速、鉴定结果准确、易于操作、灵敏度高且专一性强等特点。

本发明是采用以下技术方案实现的：

一种鉴定葡萄花翅小卷蛾的引物对，其上游引物核苷酸序列如seqidno:1所示，即：5’-caaaatagagcctcccct-3’；其下游引物核苷酸序列如seqidno:2所示，即：5’-aaacgacctggattagcat-3’。

首先，在ncbi上找到葡萄花翅小卷蛾以及已报道的10种鳞翅目卷蛾科与其形态近似种的线粒体coii基因序列全长；

其次利用mega6.0将葡萄花翅小卷蛾以及10种形态近似种的coii基因序列进行对比,从而确定出葡萄花翅小卷蛾特有的coii基因片段；

最后利用primier5针对葡萄花翅小卷蛾特有的coii基因片段设计葡萄花翅小卷蛾特异性引物对。

所设计的引物对葡萄花翅小卷蛾种群进行pcr扩增，可获得508bp大小的特异性片段。

本发明还提供一种鉴定葡萄花翅小卷蛾的试剂盒，其包含上述的引物对。进一步地，还包含pcr缓冲液、taqdna聚合酶、ddh20。

本发明还提供一种用所述的引物对鉴定葡萄花翅小卷蛾的方法，该方法是：提取待鉴定样本的基因组dna作为模板，利用权利要求1所述的引物对基因组dna中的线粒体coii基因进行pcr扩增，对扩增产物进行检测，若出现508bp的dna条带，则待测样本为葡萄花翅小卷蛾。

上述方法中，pcr扩增反应条件为：94℃下预变性3分钟；而后35个循环，每个循环包括94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。

本发明还提供一种利用所述引物对鉴定葡萄花翅小卷蛾的pcr反应体系，其包括：2×pcrmastermix12.5μl，上、下游向引物各2μl(10mm)，dna模板1.5μl，含20～50ngdna，ddh2o补足25μl。

本发明通过分子鉴定的方法获取葡萄花翅小卷蛾的一个coii基因的特异序列，然后通过基因序列相似度的比对，可实现葡萄花翅小卷蛾准确、快速的鉴定。(1)本发明操作简单，操作者不需要具备专业的形态学鉴定知识；而传统的鉴定方法操作复杂，且需要具有较强的形态鉴定知识。(2)本发明结果准确可靠，本发明方法已经对采自智利、阿根廷、以色列、意大利的葡萄花翅小卷蛾进行鉴定验证，结果的可靠性具有充分的保证。(3)本发明实用性强，可用于葡萄花翅小卷蛾幼虫、蛹、成虫的鉴定，只要获得虫体的任何一部分即可鉴定，对样本质量无要求，可用于田间害虫的预测预报，也可用于进出口岸对进口水果、苗木的检测，不仅能够缩短通关时间，而且还能够降低检疫人员的工作强度；而传统的鉴定方法对样本完整和样本质量相对要高。(4)鉴定葡萄花翅小卷蛾的特异性引物能够扩增出葡萄花翅小卷蛾的线粒体coii基因，为葡萄花翅小卷蛾的鉴定提供简便稳定的分子标记，解决区分葡萄花翅小卷蛾的难题，为今后葡萄花翅小卷蛾的生物学、种群动态监测以及综合防治奠定了基础。

附图说明

图1为葡萄花翅小卷蛾特异引物对采集自智利、阿根廷、以色列、意大利四个地方12份葡萄花翅小卷蛾样本总dna的扩增结果，其中m:dl2000marker；1-3为采集自智利的葡萄花翅小卷蛾样本；4-6为采集自阿根廷的葡萄花翅小卷蛾样本；7-9为采集自以色列的葡萄花翅小卷蛾样本；10-12为采集自意大利的葡萄花翅小卷蛾样本。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1用于鉴定葡萄花翅小卷蛾的特异pcr引物序列设计

首先，在ncbi上找到葡萄花翅小卷蛾以及已报道的10种鳞翅目卷蛾科与其形态近似种的线粒体coii基因序列全长；

其次利用mega6.0将葡萄花翅小卷蛾以及10种形态近似种的coii基因序列进行对比,从而确定出葡萄花翅小卷蛾特有的coii基因片段；

最后利用primier5针对葡萄花翅小卷蛾特有的coii基因片段设计葡萄花翅小卷蛾特异性引物对。

根据以上得到的特异序列设计引物，引物序列为：

上游引物核苷酸序列如seqidno:1所述，即：5’-caaaatagagcctcccct-3’；其下游引物核苷酸序列如seqidno:2所述，即：5’-aaacgacctggattagcat-3’。

实施例2pcr引物序列用于鉴定葡萄花翅小卷蛾

1.昆虫样本的采集

2018年3-5月份于智利、阿根廷采集葡萄花翅小卷蛾幼虫，以色列、意大利采集葡萄花翅小卷蛾幼虫和成虫，经专家准确的形态鉴定，置于无水乙醇中，保存于-20℃。

表1本发明所采集的葡萄花翅小卷蛾样本信息

2.基因组dna提取

将收集的样本，用浓度梯度为75％、50％、30％、10％、0％的酒精稀释，每个浓度2min；从无菌水中取出，用滤纸吸干虫体上的水分；将样本置于一无菌的1.5ml离心管中；用研磨棒充分研磨后，加入100μllb2和20μlproteinasek(确保组织完全进入离心管中)；55℃孵育大约3小时直至完全裂解；加入20μlrnasea于样品中，室温孵育2分钟；12000rpm离心5分钟，转移上清于一无菌离心管中；加入500μlbb2，立即涡旋5秒钟，室温孵育10分钟；将全部的溶液加入离心柱中，12000rpm离心30秒，弃去流出液；加入500μl溶液cb2，12000rpm离心30秒，弃去流出液，重复一次；加入500μl溶液wb2(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，弃去流出液，重复一次；12000rpm离心2分钟，彻底去除残留的wb2；将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入20μ预热的eb，或去离子水(ph>7.0)，室温静置一分钟，12000rpm离心一分钟，洗脱dna；重复洗脱得到更多的dna，将洗脱出来的dna于-20℃保存。

3.coii基因的扩增、测序及序列分析

(1)基因的扩增

以上一步所得基因组dna为模板，利用实施例1设计的引物对(上游引物：5’-caaaatagagcctcccct-3’，c2r：下游引物：5’-aaacgacctggattagcat-3’)对基因组dna中的线粒体coii基因进行pcr扩增；

pcr反应总体系25μl，其中2×pcrmastermix12.5μl，正/反向引物各2μl，dna模板1.5μl，ddh2o补足25μl；

pcr反应条件为：94℃下预变性3分钟；而后35个循环，每个循环包括94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min，反应产物保存在4℃。

(2)序列分析

取适量上一步得到的pcr扩增产物用琼脂糖电泳检测结果，经溴化乙锭染色后，使用1％的琼脂糖电泳，于紫外灯下观察。上述引物扩增片段大小为508bp，将得到的特异性产物测序，根据测序的结果进行比较，从而来鉴定葡萄花翅小卷蛾。

4.实验结果

测序所得的coii基因的序列和在ncbi里搜索得到的葡萄花翅小卷蛾的序列相似度均为100％，鉴定准确率为100％。

实施例3葡萄花翅小卷蛾与其它近似种序列比对

1.在ncbi下载已报道的鳞翅目卷蛾科与葡萄花翅小卷蛾近似物种的coii基因序列。

2.使用本发明提供的特异性引物扩增测序得到的葡萄花翅小卷蛾coii基因序列与其他近似种的coii基因序列通过软件clustalx1.83进行比对。

3.实验结果

通过序列比对，我们发现通过本发明提供的特异性引物扩增测序得到的葡萄花翅小卷蛾coii基因序列与ncbi上下载得到的葡萄花翅小卷蛾coii基因序列相似度为100％，其余10个与其近似物种与葡萄花翅小卷蛾coii基因序列相似度均在92％以下，说明本发明所提供的引物特异性强。

序列表1为葡萄花翅小卷蛾序列与已有报道的鳞翅目卷蛾科10个近似物种的coii序列比对，其中ah代表茶小卷叶蛾(adoxophyeshonmai)的coii基因序列，序列号为dq073916.1；gd代表沙果小食心虫(grapholitadimorpha)的coii基因序列，序列号为kj671625.1；af代表黄斑卷蛾(aclerisfimbriana)的coii基因序列；ao代表苹小卷叶蛾(adoxophyesorana)的coii基因序列，序列号为jx872403.1；cp代表苹果蠹蛾(cydiapomonella)的coii基因序列，序列号为jx407107.2；rl代表细梢小卷蛾(rhyacionialeptotubula)的coii基因序列，序列号为jx028270.1；gm代表梨小食心虫(grapholitamolesta)的coii基因序列，序列号为hq392511.1；sl代表顶梢卷叶蛾(spilonotalechriaspis)的coii基因序列，序列号为hq392511.1；cl代表苹果大卷叶蛾(choristoneuralongicellana)的coii基因序列，序列号为hq452340.1；rp代表黄杉实小卷蛾(retiniapseudotsugaicola)的coii基因序列，序列号为kf498969.1；lb代表葡萄花翅小卷蛾(lobesiabotrana)的coii基因序列，该序列通过本发明提供的特异性引物扩增测序得到。

以下内容为通过genedoc软件获得的葡萄花翅小卷蛾与其近似种coii基因序列的比对：

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种用于鉴定葡萄花翅小卷蛾的引物对及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

caaaatagagcctcccct18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaacgacctggattagcat19