SMN2基因多拷贝数的检测方法与流程

本发明基因检测技术领域，特别是一种检测smn2基因拷贝数变异的定量pcr方法。

背景技术：

脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，sma)是常染色体隐性遗传疾病，缺陷基因携带者频率可高达1/50。sma的关键基因是运动神经元生存基因(survivalmotorneuron，smn)，smn位于5号染色体长臂，包含高度同源的两拷贝，smn1和smn2。其中，smn1是sma的致病基因，约95％～98％的sma患者是由于smn1纯合缺失引起的，约2％～5％的患者是smn1发生1拷贝缺失，另1拷贝存在点突变。smn1与smn2之间存在5个差异碱基，分布在内含子6到外显子8上。smn1可以产生全长运动神经元蛋白，其同源基因smn2由于外显子7上的突变(c.840c＞t)导致smn2基因产生可变剪接体，使产生的smn蛋白不稳定或无功能，只有约10％的smn2可以翻译成全长smn蛋白。在smn1纯合缺失患者中，smn2在一定程度上可以起到补偿作用，与疾病的严重程度有关，其拷贝数越多，患者表型越轻，预后越好。在正常个体中smn2的拷贝数可以从0到6变化。

检测smn基因拷贝数变异的方法有单链构象多态性分析、变性高效液相色谱分析、高分辨熔解曲线分析、多重连接依赖性探针扩增技术和实时定量pcr技术等。单链构象多态性分析根据具有空间构象差异的单链dna在聚丙烯酰胺凝胶中的受排阻力不同来实现突变检测，该方法操作繁琐，容易出现假阳/阴性，而且对sma携带者无法检测。变性高效液相色谱分析可根据异源双链和同源双链的色谱柱洗脱差异进行检测，高自动化、高通量，可同时对smn1、smn2基因拷贝数进行检测，应用广泛，缺点是易受温度、洗脱剂等的影响，导致结果稳定性差，且需要pcr后处理，容易造成污染。高分辨熔解曲线分析法是根据熔解峰峰型差异对突变进行检测，该方法检测结果需要人工判读，准确性差，而且对模板的质量要求较高。mlpa是一种准确、快速的拷贝数检测方法，但当探针结合区存在snp时，结果会不准确，可能造成假阳性，而且操作难度较大，成本高，对标本纯度要求高。

市场需要一种成本低，且拷贝数定量的准确性高的smn2基因多拷贝数的检测方法，据相关文献和专利报道，qpcr一般可用于检测smn1和smn2基因低拷贝数，对smn2基因4拷贝以上的分辨率较低，而区别高拷贝smn2对sma疾病类型的判断以及指导临床预后有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种smn2基因多拷贝数的检测方法，能够快速、简便的检测出smn2变异的拷贝数，检测方法成本低，且检测出的拷贝数定量的准确性高。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

smn2基因多拷贝数的检测方法，包括如下步骤：

步骤一，

比对smn1和smn2基因序列，确定两个基因之间的差异位点共有五个碱基差异，位于第6号内含子、第7号外显子、第7号内含子和第8号外显子上；

根据smn2基因第6、7号内含子与smn1基因第6、7号内含子上的差异碱基设计特异性扩增smn2基因的引物；

在特异性扩增smn2基因的引物3’端倒数第三个碱基处引入错配碱基；

针对smn2基因设计特异性检测探针smn2-p，在探针的5’端和3’端做标记；

针对rpp30基因设计特异性引物rpp30-f\rpp30-r和探针rpp30-p，在探针的5’端和3’端做标记；

步骤二，通过外周血提取标本dna；

步骤三，制备pcr反应体系，进行pcr程序；

pcr反应体系包括：

补加去离子水至终体积为20～100μl。

经过pcr程序后，再进行标记采集，对拷贝数定量。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，

步骤一，根据smn2的第6号内含子差异位点设计两条特异性上游引物smn2-f0和smn2-f，所述smn2-f0将差异碱基放在引物3’末端最后一位；所述smn2-f在3’端覆盖差异碱基，同时在倒数第3位引入错配碱基g，产生强错配gt；

根据smn2第7号内含子上的差异位点设计两条特异性下游引物smn2-r0和smn2-r，所述smn2-r0是在引物3’端最后一个碱基覆盖差异碱基；所述smn2-r在3’端覆盖差异碱基，同时在倒数第3位引入错配碱基g，形成强错配ga；

根据smn2基因设计特异性检测探针smn2-p，5’端荧光标记fam，3’端荧光标记tamra；

根据rpp30基因设计特异性引物rpp30-f\rpp30-r和探针rpp30-p，探针5’端荧光标记hex，3’端荧光标记tamra。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，

smn2-f0引物序列为：ccatataaagctatctatatatagctatctata，

smn2-r0引物序列为：ttgttttacattaacctttcaactttc，

smn2-f引物序列为：ccatataaagctatctatatatagctatctgta，

smn2-r引物序列为：ttgttttacattaacctttcaactgtc，

smn2-p探针序列为：ccttacagggttttagacaaaatcaaaaagaag，5’端荧光标记fam，3’端荧光标记tamra，

smn2-f引物序列为：acttaatttctgatcatattttgttg，

smn2-r引物序列为：ctctttattgtgaaagtatgtttct，

rpp30-f引物序列为：gagctgatgcatatttataca，

rpp30-r引物序列为：tgaaataatctacaggatacagt，

rpp30-p探针序列为：tgacatagtgttcaggattcttaaaggtga，5’端荧光标记hex，3’端荧光标记tamra，

rpp30-f引物序列为：agtatttgtaattctgtttgtattg，

rpp30-r引物序列为：tgtaaacatcagtgaatagga。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，引物探针组合物包括：smn2-f，smn2-r，smn2-p，rpp30-f，rpp30-r，rpp30-p。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，探针的tm值比引物高10℃±。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，表面活性剂采用surfactin表面活性肽。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，pcr反应缓冲液采用extaq缓冲液，extaqdna聚合酶，选择性水解断裂酶采用ung酶。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，表面活性剂的浓度为0～4.8mm，所述dntps的浓度为0.01-0.18mm。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，表面活性剂的浓度为1.2～2.4mm，dntps的浓度为0.02mm。

前述的smn2基因多拷贝数的检测方法，表面活性剂的浓度为1.2mm，dntps浓度为0.02mm。

本发明的有益之处在于：

在smn2基因6、7号内含子的引物3’端倒数第三个碱基处引入错配碱基，大大降低了引物对smn1基因的非特异性扩增，提高了pcr扩增特异性；

本发明使用低用量的dntps和适量的surfactin可以增强pcr检测体系的稳定性，提高拷贝数定量的准确性；

通过实验得知，当surfactin浓度使用1.2mm，dntps用量减少到0.02mm时，smn2基因4、5、6拷贝相应2^-△△ct值之间无重叠。

附图说明

图1是本发明的生物表面活性剂surfactin的结构式；

图2是smn2-f0/smn2-r0/smn2-p加smn2质粒模板或smn1质粒模板的特异性对比图；

图3是smn2-f/smn2-r/smn2-p加smn2质粒模板或smn1质粒模板的特异性对比图；

图4是108份标本smn2基因拷贝数检测结果box统计图；

图5是dntps与surfactin用量对已知基因型标本的检测效果的影响对比图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一，验证dntps与surfactin的用量对质粒标准品的检测效果的影响：

smn2基因多拷贝数的检测方法，包括如下步骤：

步骤一，

在ucsc网站上下载smn1、smn2和参考基因rpp30序列，在clustal-x1.8软件上对比smn1和smn2基因序列，确定两个基因之间的差异位点，比对结果表明二者之间共有五个碱基差异，位于第6号内含子、7号外显子、7号内含子和8号外显子上。

根据smn2的第6号内含子差异位点设计两条特异性上游引物smn2-f0和smn2-f，所述smn2-f0将差异碱基放在引物3’末端最后一位；所述smn2-f在3’端覆盖差异碱基，同时在倒数第3位引入错配碱基g，产生强错配gt；

根据smn2第7号内含子上的差异位点设计两条特异性下游引物smn2-r0和smn2-r，所述smn2-r0是在引物3’端最后一个碱基覆盖差异碱基；所述smn2-r在3’端覆盖差异碱基，同时在倒数第3位引入错配碱基g，形成强错配ga；

根据smn2基因设计特异性检测探针smn2-p，5’端标记fam，3’端标记tamra；

根据rpp30基因设计特异性引物rpp30-f\rpp30-r和探针rpp30-p，探针5’端标记hex，3’端标记tamra。

探针tm值均比引物高10℃左右。检测体系的引物和探针均由生工合成并纯化，合成好的引物和探针使用tris-hcl(ph8.3)进行溶解，并用nd-2000(nanodrop，美国)紫外分光光度计进行浓度和纯度的测定，最后稀释至50μm，分装并保存在-80℃冰箱。

pcr体系使用的引物探针如表一所示。表中斜体碱基表示引入的错配碱基，黑色加粗和下划线碱基表示smn2与smn1的差异碱基。

表一：引物探针序列信息

步骤二，制备质粒标准品；

在smn2基因7号外显子附近区域设计一对同源引物，可同时扩增smn1和smn2基因，上游引物序列为smn2-f：acttaatttctgatcatattttgttg，下游引物序列为smn2-r：ctctttattgtgaaagtatgtttct。同时构建rpp30参照基因质粒标准品，上游引物序列为rpp30-f：agtatttgtaattctgtttgtattg，下游引物序列为rpp30-r：tgtaaacatcagtgaatagga。

将构建好的质粒按相应比例进行混合，分别得到对照质粒标准品、smn1基因质粒标准品、smn2基因质粒标准品、smn2基因4拷贝质粒标准品、smn2基因5拷贝质粒标准品和smn2基因6拷贝质粒标准品。其中对照质粒标准品包含2拷贝的smn2和2拷贝的rpp30、smn1基因质粒标准品包含2拷贝的smn1基因、smn2基因质粒标准品包含2拷贝的smn2、smn2基因4拷贝质粒标准品包含2拷贝rpp30和4拷贝smn2、smn2基因5拷贝质粒标准品包含2拷贝rpp30和5拷贝smn2、smn2基因6拷贝质粒标准品包含2拷贝rpp30和6拷贝smn2。质粒标准品可用于模拟在人群中可能出现的各种多拷贝类型，用于pcr检测体系的优化和建立。质粒标准品的混合方式如表二。

表二：质粒标准品的混合方式

步骤三，对外周血标本，采用qiagen公司的商品试剂盒提取，提取的基因组dna用nd-2000紫外分光光度计对浓度和纯度进行测定，然后用tris-hcl缓冲液(ph8.3)稀释至浓度为10～100ng/μl，最后保存在-80℃冰箱中备用。

步骤四，制备pcr反应体系，进行pcr程序；

作为一种优选，pcr反应体系的组成如表三所示：

表三：pcr体系成分及用量

pcr程序：50℃5min；95℃10min；95℃15s，59℃1min(采光)，35cyclers。在退火阶段对fam和hex通道进行荧光采集。

需要说明的是：表面活性剂采用surfactin表面活性肽。本发明考察到生物表面活性剂surfactin对更小比率拷贝数的区分能力。surfactin是由7个氨基酸和1个长链羟基脂肪酸组成，表面性能优，耐热和酸碱性，同时还具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等作用，化学分子式：c53h93n7o13，结构式如图1。

需要说明的是：作为一种优选，引物探针组合物包括：smn2-f，smn2-r，smn2-p，rpp30-f，rpp30-r，rpp30-p。图2是smn2-f0/smn2-r0/smn2-p加smn2质粒模板或smn1质粒模板的特异性对比图；图3是smn2-f/smn2-r/smn2-p加smn2质粒模板或smn1质粒模板的特异性对比图；如图2、3所示的对比可知，当设计smn2上下游引物仅在3’末端覆盖差异碱基时，smn2的引物也能扩增出其同源基因smn1的质粒模板，引物特异性较差(如图2)；而当设计smn2上下游引物覆盖3’末端差异碱基的同时，在倒数第三位碱基引入错配碱基，此时smn2的引物特异性强，仅特异性地扩增smn2质粒模板(如图3)。

需要说明是：本发明的实施例是基于荧光定量pcr方法，但是标记的方法不仅可以采用荧光法，还可以采用量子点修饰方法，量子点可分为元素半导体量子点、化合物半导体量子点和异质结量子点，与有机荧光染料相比，量子点的激发光谱宽且连续、发射光谱窄而对称、抗光漂白性强、荧光强度高等特点，将量子点与蛋白质、抗体、dna等生物大分子进行连接，可将量子点应用于生物探针荧光标识、多元生物分子光谱编码、活体实时细胞成像、生物分子海量扫描分析以及基于荧光能量共转移生物探测等场合，此标记方法同样也适用于本发明。

二，通过检测结果验证dntps与surfactin用量组合对smn2基因多拷贝数检测的作用；

设置dntps用量为4组：0.18mm、0.06mm、0.02mm、0.01mm；surfactin用量为5组：4.8mm、2.4mm、1.2mm、0.48mm、0mm，共20种随机组合。使用模板为对照质粒标准品、smn2基因4拷贝质粒标准品、smn2基因5拷贝质粒标准品、smn2基因6拷贝质粒标准品。每种标准品做4个平行管，根据软件给出的ct值，计算2^-△△ct值的平均值，如表四所示。不加surfactin时，当降低dntps的用量时，有提升多拷贝之间区分度的作用；当加入4.8mm的surfactin时，由于浓度过高，很可能对pcr反应有抑制作用，在此浓度下，改变dntps用量时，对smn2多拷贝的区分度作用不大。在surfactin用量在1.2～2.4mm范围内，dntps用量为0.02mm时，smn2基因4、5、6拷贝之间区分度较大。因此，低用量的dntps和适量的surfactin可以增强pcr检测体系的稳定性，提高拷贝数定量的准确性。最佳sμrfacton/dntps用量组合为1.2～2.4mm/0.02mm。

表四：sμrfacton/dntps用量对smn2基因多拷贝检测的作用

三，验证dntps与surfactin的用量对实际标本检测的检测效果的影响：

通过质粒标准品的考察，得出0.02mm的dntps与1.2～2.4mm的surfactin用量对smn2的拷贝数区分度有明显提高效果。为了考察在实际标本检测中是否也具有这样的区分效果。我们对原用量组合0mm/0.18mm和优化后用量组合1.2mm/0.02mm，对临床标本进行考察(smn2＝4、5、6copies)，每个标本做3个复管，2^-△△ct值取平均值，检测结果如表五。为了更清晰地看到两组用量条件下对不同拷贝数的区分情况，将检测结果制作成box图(如图4)，可以看出不加surfactin，并且dntps用量为0.18mm时，smn2基因4、5、6拷贝是区分不开的，当surfactin浓度使用1.2mm，dntps用量减少到0.02mm时，smn2基因4、5、6拷贝相应2^-△△ct值之间无重叠。

表五：已知基因型标本的检测结果

四，检测结果准确性验证：

根据以上基因组提取方法对108份已知基因型全血标本和实验室标本库中的80份随机全血标本进行提取，a260/a280在1.6-2.0。已知基因型标本中smn2基因0～4拷贝标本已采用荷兰mrc-holland公司的mlpa检测试剂盒进行检测，由医院相关工作人员进行操作和结果分析。

按pcr反应体系和实验条件对108份临床标本(每份标本做两个平行)和80份随机标本进行检测，以正常人标本做阴性对照，以去离子水做空白对照。根据软件给出的ct值，分别计算对照标本和待测标本smn2基因第7外显子目的基因与内标基因间的△ct值，△ct＝ct(fam)-ct(hex)，对照标本和待测标本的△ct值分别记为△ct1和△ct2，△△ct＝△ct2-△ct1，结果以2^-△△ct值表示。

检测结果分析：

108例已知基因型的全血标本2^-△△ct值的cv值在0.94％-4.76％之间，各基因型标本之间2^-△△ct值无重叠(表六&图5)。采用单样本t检验进行临床标本组间差异显著性分析(spss19.0)，不同smn2拷贝数标本组的2^-△△ct值之间有极显著性差异(p＜0.001)。本发明方法的检测结果与临床检测结果一致，额外检出4份5～6拷贝的多拷贝标本。临床标本检测结果准确率达到100％。

表六：临床标本cut-off值

以得到的cut-off值为标准，对80份随机标本进行筛查，smn2基因为2拷贝、1拷贝和0拷贝的标本分别有41份、28份和11份。41份2拷贝标本的2^-△△ct值平均值为1.08，sd为0.03，阈值范围为1.02～1.14(mean±2sd)，cv值为2.8％；28份1拷贝标本的2^-△△ct值平均值为0.69，sd为0.02，阈值范围为0.65～0.73(mean±2sd)，cv值为3.0％，11份smn2基因为0拷贝的标本，在fam通道无信号升起。以上随机标本2^-△△ct值均落在cut-off内，说明本发明方法的准确性高、体系稳定性好。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。