远志环阿屯醇合酶基因PtCAS及其应用的制作方法

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及环阿屯醇相关基因—环阿屯醇合酶基因ptcas的功能验证及在酵母中的应用。

背景技术：

植物次生代谢产物是植物中一类并非其生长发育所必需的小分子有机化合物，它们由初生代谢衍生而来，并且在种属、器官组织及生长发育期等方面具有特异性。目前约10000种次生代谢产物被发现，依据不同的分类方法，他们被分为酚类、萜类、皂苷、生物碱、甾醇类等。植物甾醇是植物体内构成细胞膜的成分之一，也是多种激素、维生素d及甾族化合物合成的前体，甾醇类化合物有降低胆固醇、防治心血管疾病、清除自由基、抗脂质过氧化、抗癌、免疫调节、抗炎作用、类激素功能、调节生长及抗病毒活性等功能。植物中，甾醇皂苷由异戊二烯途径合成。鲨烯合酶(squalenesynthase，sqs)及鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase，sqe)分别催化法呢酯焦磷酸生成鲨烯并氧化生成2,3-氧鲨烯，2,3-氧化鲨烯在各种氧鲨烯环化酶类(oxidosqalenecyclases，oscs)的催化下，经过质子化、环化、重排和去质子化反应，得到三萜皂苷和植物甾醇的前体，这是产生种类各异的三萜皂苷的基础及关键反应。在植物中，甾醇下游合成路径中的第一个酶是环阿屯醇合酶(cycloartenolsynthase，cas)。环阿屯醇是由2,3-氧鲨烯催在cas的催化下生成的，接着再由一系列oscs催化生成麦角甾醇。现有20多种植物的cas基因被发现。如拟南芥(arabidopsisthaliana)，光果甘草(glycyrrhizaglabra)，人参(panaxginseng)等。我国验证了三七(panaxnotoginseng)，平贝母(fritillariaussuriensismaxim)等中药中的cas基因。

远志(polygalatenuifoliawilld.)，是我国重要的大宗药材之一。2015年版《中国药典》记载远志具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿之功效。植物次生代谢物是中药发挥药效的物质基础，远志中的次级代谢物主要有皂苷类、口山酮类和糖脂类。而皂苷类成分则是远志发挥益智等传统功效和抗衰老及脑保护等现代药理作用的主要贡献者。远志皂苷和甾醇均由共同的前体物质2,3-氧化鲨烯在不同合酶基因的作用下，沿着各自的代谢方向进行生物合成。

本发明通过在远志中克隆得到基因ptcas，经序列比对发现ptcas与其他物种中的类似基因相比有高度同源性。因此，ptcas可能发挥催化2,3-氧鲨烯，即合成环阿屯醇的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种远志中环阿屯醇相关基因—环阿屯醇合酶基因及其在制备麦角甾醇中的应用。

本发明提供的一种远志齐墩果酸合酶基因ptcas，其特征在于：所述基因ptcas的cdna序列如seqidno.1所示。

本发明还提供的一种含有上述环阿屯醇合酶基因ptcas的酿酒酵母表达载体，其特征在于：所述载体克隆区域核苷酸序列如seqidno.2所示。

该酿酒酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤：

从远志中克隆得到环阿屯醇合酶基因ptcas；使用重叠延伸pcr技术构建基因元件；使用酶切连接的方式构建质粒prs304-adh1p-ptcas-ala1t；经测序验证后，将此质粒以醋酸锂转化的方式转入酿酒酵母中。

经代谢物检测麦角甾醇的产量为86.8mg/l，比空白菌株中麦角甾醇的产量高1.06倍。

本发明的有益效果：本发明利用植物基因工程技术，克隆得到远志环阿屯醇合酶基因ptcas，并构建含有远志环阿屯醇合酶基因ptcas的酿酒酵母表达载体，将该载体转入空白酿酒酵母w303a中，经过代谢物检测，本发明构建的酿酒酵母工程菌中麦角甾醇的产量为86.8mg/l，比空白菌株中麦角甾醇的产量高1.06倍。本发明远志环阿屯醇合酶基因ptcas可在制备麦角甾醇中应用。

附图说明

图1为构建质粒prs304-adh1p-ptcas-ala1t的琼脂糖凝胶电泳图，图中：1：adh1p；2：ptcas；3：ala1t；4：adh1p-ptcas-ala1t；5：prs304-adh1p-ptcas-ala1t；m：dl10000marker

图2为prs304-adh1p-ptcas-ala1t的载体示意图

图3为对照品麦角甾醇与酿酒酵母菌株的gc-ms图，图中：a：对照品麦角甾醇的二级质谱图与色谱图；b：空白菌株w303a的色谱图；c：菌株ptcas的色谱图

具体实施方式

实施例1远志ptcas的时空表达分析

1.1样品来源

本实施例中采用的远志药材采集于山西新绛。样品以每一铝箔纸包为计数单位，每一包样品至少采集3株以上远志，用铝箔纸包好，迅速保存于液氮中，再转移至-80℃保存。样品包含一年、二年、三年生的根、茎、叶、花样品。

1.2远志总rna的提取

采用trizol法提取不同年限远志及不同组织的rna，提取过程中离心操作均为4℃、12000rpm，离心5min。具体操作如下：

(1)枪头、ep管用121℃灭菌20min，待用；干净的研钵、药勺用铝箔纸包好，180℃干烘5h，待用；

(2)研钵用液氮预冷，取新鲜的植物样本于研钵中，加入液氮，研至粉末；

(3)在无rnase的ep管中加入1mltrizol，再加大约100mg的样品粉末至ep管中，用力摇晃使细胞壁破碎，保证trizol可以充分裂解细胞释放的rnase，室温静置5min后离心；

(4)转移上清至另一无rnase的ep管，加200μl氯仿萃取，上下颠倒混匀，静置5min后离心，此时rna在上层水相中；

(5)小心将上层水相转移至另一无rnase的ep管(在吸上层水相时，尽量避免吸入蛋白质，以免影响rna质量。若不慎混有蛋白质，可重复步骤4，再用氯仿萃取一次)，加等体积异丙醇，静置10min后离心，弃上清；

(6)加入1ml的75％乙醇清洗沉淀，离心，重复两次；

(7)弃上清，待乙醇挥尽，用depc水溶解rna，-80℃保存。

提取后总rna用nanodrop2000检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。浓度及完整性均符合要求，方可进行下一步操作。

1.3.cdna的合成

(1)配制混合液1(见表1)，在pcr仪上70℃保温10min，迅速转移至冰上，放置2min以上；

(2)离心，配制混合液2(见表2)，42℃孵育1h；

(3)在pcr仪上70℃保温15min后，冰上冷却，便得到cdna溶液。

表1混合液1的配制表

表2混合液2的配制表

1.4引物设计与合成

根据远志ptcas的全长序列设计引物，由primerpremier5执行。内参基因为cdc42，其unigene来源于远志转录组测序得到的c26151_g1_i1。引物由南京金斯瑞公司进行合成。引物ptcas-f为5′-atcccttacattcttccgttcc-3′，ptcas-r为5′-gatcttccttggcacactgactac-3′；cdc42-f为5′-ctgctggacaggaagattacg-3′，cdc42-r为5′-ctcggacattctcgaatgaag-3′。

1.5实时荧光定量pcr(rt-qpcr)

将cdna稀释10倍后作为模板，用sybrpremixextaq^tmⅱ型试剂盒及cg-05型realtimepcr仪进行rt-qpcr实验，分析ptcas在不同年限远志的不同组织中mrna的表达水平。内参基因为cdc42。每个样本进行3个生物学重复，每个生物学重复进行3个技术重复。反应体系共20μl如表3，反应程序：95℃1min；95℃15s，60℃15s，72℃45s；40个循环。反应后进行熔解度实验。

表3rt-qpcr体系

1.6数据处理

mrna表达量根据ptcas及cdc42获得的ct值，用2^-δct转化为相对定量数据。根据mrna的时空表达量，最终选择二年生远志根作为模板进行ptcas基因全长的获取。

实施例2远志ptcas表达载体的构建

2.1引物合成

pcr引物由南京金斯瑞公司合成，构建远志ptcas表达载体所用引物见表4。表中加粗斜体为酶切位点。

表4实验所用引物

2.2基因元件的扩增

用酵母基因组dna提取试剂盒提取酵母dna，以其为模板，扩增酿酒酵母启动子adh1p，终止子alait。以二年生远志根cdna为模板扩增ptcas。扩增体系见表5，运行程序为98℃10s，55～60℃5s，72℃1kb/min；共30～35个循环。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物的正确性，对目的条带切胶，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行胶回收。

表5常规pcr反应体系

2.3重叠延伸pcr(oe-pcr)组装基因元件

oe-pcr可通过两步pcr，在体外将两个基因元件连在一起。通过oe-pcr依次连接adh1p，ptcas，ala1t，得到两端具有酶切位点的adh1p-ptcas-adh1t。具体操作如下：

(1)无引物预连

表6为无引物预连接的反应体系，体系中片段1与片段2的摩尔比相同。预连接程序为：98℃10s，tm减(5～8)℃5s，72℃1kb/min，扩增13个循环。

(2)连接

连接体系以预连接产物为模板，加入两个片段的外侧引物进行扩增，得到片段1-2。连接的反应体系及运行程序与“2.2基因元件的扩增”操作一致。1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定oe-pcr产物，并对目的产物进行切胶回收。

表6无引物预连接反应体系

2.4酶切连接构建质粒

以apai和ecori分别双酶切质粒prs304(购自atcc)与adh1p-ptcas-ala1t，胶回收目的片段，以质粒与外源基因摩尔比＝1:3用t4连接酶连接，表7为连接体系，16℃连接6h，构建prs304-adh1p-ptcas-ala1t，测序验证。图1和图2分别为质粒prs304-adh1p-ptcas-ala1t的琼脂糖凝胶电泳图及载体构建示意图。

表7连接体系

2.5连接产物的转化

(1)取dh5α感受态50μl置于冰上，在刚要融化时，加入连接产物5μl，轻悬使其混匀，冰浴静置30min。

(2)42℃热激90s，迅速转移至冰浴冷却2min，该过程不要摇晃ep管。

(3)加入900μl无菌不含抗生素的lb液体培养基，混匀后37℃150rpm摇床孵育50min，使抗性基因表达。

(4)4000rpm离心2min，去上清，剩余200μl菌液涂至含相应抗生素的lb平板上，静置30min，37℃倒置12-16h。

(5)挑单菌落至含抗生素的液体培养基，37℃150rpm摇床培养12-16h。

(6)使用常规pcr扩增目的基因表达盒进行验证。

(7)将pcr验证正确的菌液送至上海派森诺生物科技股份有限公司测序验证。得到测序结果，如序列seqidno.2所示。

2.6远志ptcas酵母表达载体的构建

将质粒prs304-adh1p-ptcas-ala1t以醋酸锂转化的方式转入酿酒酵母w303a(购自atcc)中。具体操作如下：

(1)在空白酿酒酵母w303a平板上挑取生长良好的酵母单菌落至5mlypd液体培养基中，30℃200rpm过夜培养16h。

(2)以10％体积比将酵母菌液转置新鲜的培养基中，30℃200rpm培养5-8h；

(3)冰浴冷却30min，使细胞代谢停止，收集1ml菌体于ep管中，4000rpm离心5min，弃上清；

(4)用1ml预冷的无菌水清洗沉淀，4000rpm离心5min，弃上清，重复两次。

(5)0.1m醋酸锂溶液对细胞进行预处理，室温静置5min，4000rpm离心5min，弃上清。

(6)煮沸ss-dna10min，冰水中快速冷却，依次加入240μl50％peg3350，36μl1m醋酸锂，10μl单链鱼精dna(煮沸ss-dna10min，使其变为单链)，64μl无菌重蒸水和6μldna片段混匀，移液器吹打或涡旋使完全混匀。

(7)30℃孵育30min，42℃热激45min，4000rpm离心5min收集细胞。

(8)用1ml室温无菌水立即清洗沉淀，4000rpm离心5min，重复两次。

(9)弃部分上清，将剩余菌液重悬，涂布于sc-trp培养基中，静置30min后，30℃培养箱中倒置2-3天观察生长状况。

(10)挑取单菌落至sc-trp液体培养基中，30℃200rpm过夜培养。利用菌液pcr进行验证。

实施例3酵母代谢物的提取及检测

3.1对照品溶液的配制

精密称取麦角甾醇对照品适量，甲醇定容，制成质量浓度为1.00mg/ml的对照品溶液。

3.2酵母代谢物的提取

将od为1的上述酵母菌液以10％的体积比转入50ml的sc-trp液体培养基中发酵14天。取新鲜发酵的酵母菌液40ml，5000rpm离心5min收集菌体。用10ml含有50％乙醇的浓度为20％的koh溶液重悬菌体煮沸10min，使细胞壁破裂代谢物释放。待温度降至室温，加入10ml正己烷萃取两次，合并两次上层正己烷相，氮气吹干。

样品用吡啶及bstfa(体积比为1:2)85℃加热1h进行硅烷化处理。gc-ms检测代谢物。所用gc型号为6890，ms型号为5975b(agilent)，色谱柱为zb-5(phenomenex，规格为30.0m×250μm×0.25μm)，载气为氦气，流速1ml/min，进样量2μl，进样口温度280℃，柱箱起始温度80℃，保持1min，以20℃/min速度升温至280℃，保持45min，以20℃/min的速度升温至320℃，保持1min。ms传输线温度为250℃，质谱离子源温度为230℃，四级杆温度150℃。质谱扫描范围为m/z60-800，结果见图3。

结果证实本发明构建的酵母菌株中麦角甾醇的产量为86.8mg/l，比空白菌株中麦角甾醇的产量高1.06倍。

序列表

<110>山西大学

<120>远志环阿屯醇合酶基因ptcas及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2292

<212>dna

<213>远志(polygalatenuifoliawilld)

<400>1

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