本发明涉及一种工程菌及其在酪醇生产中的应用，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：酪醇(tyrosol)又名对羟基苯乙醇，是红景天属植物中广泛存在的一种成分，是红景天苷的苷元，同时也是橄榄油中的主要酚类化合物之一。由于它的抗氧化能力使其具有多种药理作用，尤其擅长清除毒性很大的羟基自由基，具有抗基因毒性的活性并抑制角质形成细胞凋亡，还通过减少细胞粘附分子的表达来防止内皮功能障碍，并抑制血小板诱导的聚集，酪醇抑制低密度脂蛋白氧化，因此被认为可以预防冠心病，还可以预防肿瘤的发生。酪醇性质温和，几乎没有毒副作用，是一种功能强大的治疗性食品和饮食补充剂，在医药和食品领域具有广阔的应用前景。近年来酪醇受到全世界研究者的广泛关注。目前酪醇的制备主要通过化学合成的方法。迄今为止，有很多化学合成工艺，例如，苯酚及其苯酚衍生物合成法、羧酸合成法、苯乙醇醇合成法、对硝基甲苯合成法等工艺。在这众多的化学合成方法中，目前国内真正实现工业化生产的仅有以苯酚及其衍生物和苯乙醇为原料的化学合成。以苯乙醇为原料合成为例，大多是采用先将苯乙醇的羟基保护，然后硝化、还原、重氮化、水解得到对羟基苯乙醇，收率为70％。在硝基还原成氨基的过程中，采用不同的催化剂可以得到不同产率的胺，主要的催化剂有铂黑和二氯化锡，所得到的产率分别为90％和88％。这种化学合成工艺产率虽然高，但是它的缺点是苯乙醇的价格贵，供应紧张。在以对溴酚为原料的合成过程中，经苄基保护、烃化、脱苄基合成得到酪醇，总收率为54.5％，(酪醇合成方法的改进，中国药物化学杂志,2002,12(3),166-168)。通过化学合成的方法虽然能成功合成酪醇，但由于原料和试剂成本昂贵，反应过程中产生许多副产物，并且合成步骤较长，反应剧烈不易控制等缺点，使得化学合成方法不适合工业化生产。除此之外，由于酪醇是重要的食品、药物、保健品的原材料，因此通过化学方法得到的产品不受人们欢迎。cn200910022997.x报道了一种从橄榄多酚粗品中生产酪醇的方法。虽然此方法的原料便宜，但是在提取的过程中，该方法需要大量的有机溶剂，并且酪醇的回收率不稳定。cn201510004953.x报道了一种高纯度酪醇的制备方法,通过加水进行煎煮、超声或微波提取红景天药材中的酪醇，再进一步浓缩、纯化、两次醇沉、在上聚酰胺柱进行水洗脱、浓缩、大孔树脂柱进行洗脱，该方法经过萃取结晶获得纯度大于80％的酪醇。但是该工艺操作过程复杂，不适合工业化生产；并且过程中用到乙酸乙酯等有机试剂，并且原材料价格相对较贵。目前市场上的这一类物质主要是工业化生产，但由于市场对绿色酪醇的需求不断骤增，因此通过微生物法生产的方法受到了广泛的关注。2008年，sumanghosh等人提出以酪氨酸为底物，在白色念珠菌作用下，通过调节ph、o2等条件，最后得到酪醇的产量为1.7g/g(干重)，此代谢过程首先将酪氨酸在转氨酶作用下生成4-羟基苯丙酮酸，再在酮酸脱羧酶作用下生成苯乙醛，再经醇还原酶生成酪醇(regulationofaromaticalcoholproductionincandidaalbicans,applenvironmicrob,2008,74(23),7211–7218)。该方法虽然获得绿色酪醇，但是由于细胞内的酮戊二酸有限，而且细胞内的nad+合成速度缓慢，所以酪醇的合成速率势必受到影响。daeunchung等通过构建的大肠杆菌表达芳香醛合酶与水解酶生成531mg/l酪醇，(productionofthreephenylethanoids,tyrosol,hydroxytyrosol,andsalidroside,usingplantgenesexpressinginescherichiacoli,scientificreports,2017,7(2578))。该方法采用大肠宿主过表达植物蛋白的策略，但是由于植物蛋白在大肠宿主中不兼容的特性，致使构建的大肠杆菌产酪醇的产量很低。中国发明专利cn201510242626.8公开了一种以大肠杆菌为宿主过表达来源于酿酒酵母的芳香族氨基酸氨基转移酶的aro10和丙酮酸脱羧酶aro8，以酪氨酸为底物合成酪醇；该方案的不足之处在于酪醇对菌体有毒性，还有就是外源蛋白aro10和aro8表达量较低；因此生产酪醇的效率较难提高，还有利用大肠杆菌中的乙醇脱氢酶，势必影响了醛还原的速率。中国发明专利cn201310133238.7报道了一种大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用，该方法利用大肠杆菌本身合成的4-羟苯基丙酮酸，引入酵母菌的4-羟苯基丙酮酸脱羧酶将其转化为4-羟基苯乙醛，再将4-羟基苯乙醛在大肠杆菌本身的脱氢酶作用下生成酪醇。虽然该方法采用微生物的方法转化葡萄糖或酪氨酸生成酪醇，但是异源表达不兼容，且受辅酶等因素的影响，致使酪醇的合成速率缓慢，无法工业化生产。中国发明专利cn201711054680.5公开了异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法。该方案在宿主中高效表达了氨基转移酶(aminotransferase)，酮酸脱羧酶(ketoaciddecarboxylase)，醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase)来生产酪醇。该方案的缺点是需要外加许多昂贵的辅酶磷酸吡哆醛(plp)和还原型辅酶ⅰ(nadh)，在自身辅酶有限的情况下，致使酪醇的得率很低。目前采用多酶串联表达构建的全细胞催化简单前体，生成相应的高副加值产物已经被广泛应用(constructingbiocatalyticcascades:invitroandinvivoapproachestodenovomulti-enzymepathways,acscatal.,2017,7(1),710–724)，而且全细胞的获取更加简单方便，并实现对廉价底物的高效转化，有时比葡萄糖的从头合成更加经济有效。据文献(metabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaefortheproductionof2-phenylethanolviaehrlichpathway,biotechnologyandbioengineering,2014,111(1),115-124.)报道，在以酿酒酵母为宿主构建的基因工程菌，以l-苯丙氨酸为原料，催化生成2-苯乙醇，产量达到6.1g/l，产率为82.5％。在以克雷酵母为宿主的研究中，以20g/l葡萄糖为原料，在不加l-苯丙氨酸的前提，下，获得苯乙醇的产量为1.3g/l，其得率远远小于以产物前体为原料，(biosynthesisof2-phenylethanolfromglucosewithgeneticallyengineeredkluyveromycesmarxianus,enzymeandmicrobialtechnology,2014,61–62,44–47)。基于目前各种方法的缺陷，研究一种可工业化生产、同时利用廉价底物可以高效制备酪醇的方法非常有必要。技术实现要素：基于目前各种方法的缺陷，本发明提供了一种酪醇的生产方法，并构建了以大肠杆菌为宿主的重组菌，实现芳香族氨基酸转移酶、酮酸脱羧酶、醇脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶的串联表达，达到利用廉价底物l-酪氨酸高效生产酪醇的效果。同时本发明解决了该菌株的构建和应用的技术问题。本发明的第一个目的是提供一株能低成本生产酪醇的大肠杆菌重组菌；所述大肠杆菌重组菌同时表达4种酶，分别为l-α-氨基酸转氨酶、l-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类分解基因。在一种实施方式中，所述l-α-氨基酸转氨酶来自escherichiacolibl21、lactobacillusplantarumatcc14917、lactobacillusparacaseiatcc334。在一种实施方式中，所述l-α-氨基酸转氨酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_000462687.1、wp_000486988.1、wp_003643296.1、yp_806114.1的序列。在一种实施方式中，所述l-α-氨基酸转氨酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(989603..990793)、nc_012892region:4174517..4175710、nz_gl379768region:complement(121900..123087)、nc_008526region:complement(840419..841594)的序列。在一种实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶来自escherichiacolibl21、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940、bacillussubtilis168。在一种实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_000373021.1、wp_011338202.1、wp_003497202.1、wp_010886557.1序列。在一种实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nc_012892region:1786741..1788084、nc_007493region:complement(2129131..2130558)、nz_ke992901region:complement(17603..18955)、nc_000964region:complement(2402067..2403350)的序列。在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶来自proteusmirabilisatcc29906或lactococcuslactisatcc19435。在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_004247067.1、wp_025016816.1的序列。在一种实施方式中，所述α-酮酸脱羧酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_gg668593region:50463..52112、nz_lklc01000008region:208327..209973的序列。所示。在一种实施方式中，所述醇脱氢酶来自e.colibl21(de3)。在一种实施方式中，所述醇脱氢酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_001318460.1、wp_000692754.1的序列。在一种实施方式中，所述醇脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nc_012892region:4406777..4407796、nc_012892region:312506..313555的序列。在一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌，是采用prsfduet-1和pcdfduet-1双质粒共表达编码这4个酶的基因；prsfduet-1装载l-α-氨基酸转氨酶基因和l-谷氨酸脱氢酶，pcdfduet-1装载α-酮酸脱羧酶基因和醇脱氢酶基因，然后将两个重组质粒转化到相应菌株，得到重组工程菌。在一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌是将2个共表达重组质粒转化到宿主escherichiacolib21感受态细胞中得到的。在一种实施方式中，所述酚类分解基因为hpad、mhpb中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述酚类分解基因的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。在一种实施方式中，所述重组菌强化表达了谷氨酸转运基因、nad合成基因、磷酸吡哆醛合成基因的一种或者多种。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将escherichiacolibl21(de3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为glts(谷氨酸转运基因)、nada(nad合成基因)、pdxj(磷酸吡哆醛合成)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述glts在ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(3694931..3696136)；nada为nc_012892region:740487..741530；pdxj为nc_012892region:complement(2567591..2568322)。本发明的第二个目的是提供一种生产酪醇的方法，所述方法是利用本发明的大肠杆菌重组菌。在一种实施方式中，所述生产酪醇所用的底物为l-酪氨酸。在一种实施方式中，所述生产酪醇化合物，是进行全细胞转化生产。在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括：新鲜细胞湿重为1-200g/l，l-酪氨酸1-200g/l，l-谷氨酸1-200g/l，ph6.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。本发明的有益效果：本发明构建了一种新型的四酶共表达基因工程菌，该菌可应用于酪醇的生产。本发明选择的l-α-氨基酸转氨酶、l-谷氨酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，因此在此工程菌的作用下可以催化l-酪氨酸产生酪醇。进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解，提高了重组菌的生产效率。利用本发明的重组菌转化生产酪醇的方法，过程简单且原料易得价格低廉，具有良好的工业化应用前景。具体实施方案本发明的重组菌的功能核心在于可以同时表达4种酶，分别为l-α-氨基酸转氨酶、l-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，l-谷氨酸脱氢酶以菌体内的nad+为辅酶将l-谷氨酸脱氢生成α-酮戊二酸和nadh；l-α-氨基酸转氨酶将l-赖氨酸转生成4-羟基苯丙酮酸，并实现了l-谷氨酸的再生，从而维持转化体系中l-谷氨酸浓度的恒定；随后经由α-酮酸脱羧酶作用生成4-羟基苯乙醛；醇脱氢酶利用谷氨酸脱氢过程生成的nadh将4-羟基苯乙醛还成酪醇，同时实现了辅酶nad+的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。实现了全细胞四酶串联一步法将l-酪氨酸转化为酪醇。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：1、本发明所涉及的菌株及质粒购自美国菌种保藏中心atcc的lactobacillusplantarumatcc14917、lactobacillusparacaseiatcc334、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940、proteusmirabilisatcc29906、lactococcuslactisatcc19435。购自novagen公司的prsfduet-1质粒、pcdfduet-1质粒、escherichiacolibl21(de3)、escherichiacolibl21dh5α。2、大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达(1)大肠杆菌酚类化合物分解相关的基因的敲除本发明中的酚类物质都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(biodegradationofaromaticcompoundsbyescherichiacoli，microbiolmolbiolrev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpad和mhpb,ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。(2)大肠杆菌谷氨酸转运基因的组成型强化表达在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强谷氨酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择谷氨酸转运相关的基因是glts，ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(3694931..3696136)。芳香族氨基酸在细胞培养过程中需要吸收氨基酸等，因此菌体本身会表达大量的氨基酸转运蛋白，无须再强化表达。(3)大肠杆菌辅酶合成相关重要基因的组成型强化表达在醇还原酶还原过程中需要以nadh为辅酶，强化表达大肠杆菌nad+合成途径的关键酶，可以提高菌体内的nad+水平，从而有利于酪醇的生成。选择的基因有nada。ncbi上accessionno为：nc_012892region:740487..741530。磷酸吡多醛(胺)是l-α-氨基酸转氨酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxj,有利于l-酪氨酸的分解。ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(2567591..2568322)。3、酶的选择(1)l-α-氨基酸转氨酶的选择l-α-氨基酸转氨酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞中。通常活力最高的是以α-酮戊二酸或草酰乙酸为受氨体的转氨酶(geneticcharacterizationofthemajorlactococcalaromaticaminotransferaseanditsinvolvementinconversionofaminoacidstoaromacompounds,appl.environ.microbiol.,199965(11)4873-4880)。从lactobacillusplantarumatcc14917、lactobacillusparacaseiatcc334中分别克隆得到l-α-氨基酸转氨酶基因lparo、lcaro，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_003643296.1、yp_806114.1的序列。从escherichiacolibl1(de3)中克隆得到两个l-α-氨基酸转氨酶基因ecaro1、ecaro2，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_000462687.1、wp_000486988.1。(2)α-酮酸脱羧酶的选择根据文献报道选择细菌来源于的，对芳香族酮酸具有明显活性的α-酮酸脱羧酶，较其它专利中酵母或植物来源的相比具有更好地在大肠杆菌中表达的特性(characterisationofathiaminediphosphate-dependentalpha-ketoaciddecarboxylasefromproteusmirabilisjn458,foodchem.,2017,232,19-24)。本发明分别从proteusmirabilisatcc29906和lactococcuslactisatcc19435中分别克隆得到α-酮酸脱羧酶基因pmkdc和llkdc，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_004247067.1、wp_025016816.1的序列，其核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_gg668593region:50463..52112、nz_lklc01000008region:208327..209973的序列。(3)醇脱氢酶的选择醇脱氢酶广泛存在于各类细菌中，根据文献报道大肠杆菌本身也含有多种底物广泛的醇脱氢酶(productionofaromaticcompoundsbymetabolicallyengineeredescherichiacoliwithanexpandedshikimatepathway,appl.environ.microbiol.2012,78(17),6203-6216)，因此直接从escherichiacolibl21(de3)克隆得到两个醇脱氢酶基因ecadh1和ecadh2，所述醇脱氢酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_001318460.1、wp_000692754.1的序列，其核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nc_012892region:4406777..4407796、nc_012892region:312506..313555的序列，从而更有利于醇脱氢酶在大肠杆菌中的过表达。(4)l-谷氨酸脱氢酶的选择l-谷氨酸脱氢酶是几乎所有生物中连接碳源和氮源代谢的关键酶。其中的l-谷氨酸是最为廉价的一种氨基酸，脱氢后生成的α-酮戊二酸可作为l-赖氨酸受氨体。l-谷氨酸脱氢酶以l-谷氨酸为底物将l-谷氨酸上生成的氢传递给辅酶nad+或nadp+，从而生成nadh或nadph。nadh或者nadph可以作为前述的醇脱氢酶的供氢体(structuralbasisforthecatalyticmechanismandα-ketoglutaratecooperativityofglutamatedehydrogenase,jbiolchem,2018,293(17),6241-6258)。本发明从escherichiacolibl21、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940、bacillussubtilis168中分别得到l-谷氨酸基因ecgdh(氨基酸序列是wp_000373021.1)、rsgdh(氨基酸序列是wp_011338202.1)、csgdh(氨基酸序列是wp_003497202.1)、bsgdh(氨基酸序列是wp_010886557.1)。4、四酶共表达体系的构建及细胞的培养将以上选择的l-α-氨基酸转氨酶、l-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶酶中每类任选一个酶，进行四酶组合共表达。目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含t7启动子和rbs结合点，理论上来讲因为每个基因前都有t7和rbs，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。本发明采用prsfduet-1和pcdfduet-1双质粒共表达四基因，prsfduet-1装载l-α-氨基酸转氨酶基因和l-谷氨酸脱氢酶基因，pcdfduet-1装载α-酮脱羧酶基因和醇脱氢酶基因。得到共表达重组质粒后，将两种重组质粒同时转入大肠杆菌escherichiacolib21感受态细胞中，利用含有卡那霉素(ampicillin)和链霉素(kanamycin)平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。5、全细胞转化酪醇化合物全细胞转化体系为：l-赖氨酸浓度为1-200g/l，l-谷氨酸浓度为1-200g/l，调节ph在6.0-9.0之间，新鲜湿菌体量为1-200g/l。然后于15-40℃，转化1-48小时。转化结束后液相色谱测定酪醇的产量。l-赖氨酸溶解度为0.1,g/ml，高浓度情况下是含有不溶物的混悬液。6、样品的检测分析酪醇定量分析：转化液采用perkinelmerseries200高效液相色谱仪检测分析，色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦megresc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测波长210nm。为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1基因的克隆(1)引物设计设计用于pcr扩增的引物。(2)pcr扩增按照takara公司genomicdnapurificationkit试剂盒的使用说明书，抽提处于对数生长期的野生菌株的基因组dna，用表1中的引物，以各对应菌株抽提的基因组为模板进行pcr扩增。扩增体系为：primestarhsdnapolymerase(2.55u/μl)0.5μl、10×primestarbuffer10μl、dntpmixture(2.5mmeach)4μl、模板dna1μl、up引物(20μm)1μl、down引物(20μm)1μl、ddh2o补足到50μl。扩增程序为：94℃，10min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min，共30个循环；72℃，10min。pcr产物送华大基因测序。后从lactobacillusplantarumatcc14917、lactobacillusparacaseiatcc334分别克隆得到l-α-氨基酸转氨酶基因lparo、lcaro，从escherichiacolibl21(de3)中克隆得到两个l-α-氨基酸转氨酶基因ecaro1、ecaro2；从escherichiacolibl21、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940、bacillussubtilis168中分别得到l-谷氨酸脱氢酶基因ecgdh、rsgdh、csgdh、bsgdh；从proteusmirabilisatcc29906、lactococcuslactisatcc19435分别得到α-酮酸脱羧酶基因pmkdc、llkdc；从escherichiacolistrainbl21得到乙醇脱氢酶基因ecadh1、ecadh2。(3)prsfduet-1单基因质粒的构建将prsfduet-1载体质粒和步骤(2)中lparo、lcaro、ecaro1、ecaro2的pcr产物于37℃水浴下双酶切1h。酶切体系为：10×cutbuffer5μl，dna10μl，限制性内切酶sacⅰ和限制性内切酶hindⅲ各1μl，无菌水33μl。将prsfduet-1载体质粒和步骤(2)中ecgdh、rsgdh、csgdh、bsgdh的pcr产物于37℃水浴下双酶切1h。酶切体系为：10×cutbuffer5μl,dna10μl，限制性内切酶ndeⅰ和限制性内切酶xhoⅰ各1μl，无菌水33μl。然后分别回收酶切产物，并于16℃水浴下连接12h-16h，prsfduet-1分别与lparo、lcaro、ecaro1、ecaro2进行连接，prsfduet-1分别与ecgdh、rsgdh、csgdh、bsgdh进行连接。连接体系为：10×dnaligasebuffer2.5μl，dna片段8μl，载体dna2μl，t4dnaligase1μl，无菌水11.5μl共25μl。随后将25μl连接液转入100μldh5α感受态细胞，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1ml不含抗生素的lb培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将含prsfduet-1重组质粒的细胞均匀涂布在含卡那霉素的lb平板上，挑单菌落培养12h，然后提取质粒，双酶切验证其正确性，同时进行dna测序以保证其准确性，最后保存正确转化子，得到如下质粒：含有l-α-氨基酸转氨酶基因的重组质粒prsfduet-lparo、prsfduet-lcaro、prsfduet-ecaro1、prsfduet-ecaro2；含有l-谷氨酸脱氢酶的基因的重组质粒prsfduet-ecgdh、prsfduet-rsgdh、prsfduet-csgdh、prsfduet-bsgdh。然后将重组质粒转入100μlbl21感受态细胞中，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1ml不含抗生素的lb培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将含prsfduet-1重组质粒的细胞均匀涂布在含卡那霉素的lb平板上，待单菌落长出后进行菌落pcr验证，挑取有条带的单菌落培养12h，保存备用。表1：pcr扩增所使用引物实施例2l-α-氨基酸转氨酶的筛选，从实施例1中获得多种含l-α-氨基酸转氨酶基因的重组工程菌，并在escherichiacolibl21(de3)中得到表达。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。收集细胞、破胞测定粗酶液活性，以α-酮戊二酸为受体时比较各种酶的活性，根据文献(转氨酶催化不对称合成芳香族l-氨基酸.生物工程学报，2012，28(11):1346-1358.)所述的方法测定l-α-氨基酸转氨酶的活性，结果如表2所示。因此选择来源于lactobacillusparacaseiatcc334的l-α-氨基酸转氨酶lcaro用于l-赖氨酸的转氨脱氨是最佳的。表2不同l-α-氨基酸转氨酶的活性比较重组菌活性u/mle.colibl21/prsfduet-ecaro13.2e.colibl21/prsfduet-ecaro21.8e.colibl21/prsfduet-lparo2.6e.colibl21/prsfduet-lcaro3.6实施例3l-谷氨酸脱氢酶的筛选，从实施例1中获得多种含l-谷氨酸脱氢酶的基因的重组工程菌，根据实施例2中的诱导表达方法，并在e.colibl21(de3)中得到表达。根据文献(纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定.上海交通大学学报·农业科学版，2010，1:82-86.)破胞测定粗酶液活性，所述的方法测定l-谷氨酸脱氢酶以nad+为辅酶的活性，结果如表3所示。因此选择来源于枯草芽孢杆菌的l-谷氨酸脱氢酶bsgdh用于酪醇的生产为最佳。表3不同l-谷氨酸脱氢酶的活性比较重组菌活性u/mle.colibl21(de3)/prsfduet-ecgdh0.8e.colibl21(de3)/prsfduet-rsgdh2.1e.colibl21(de3)/prsfduet-csgdh2.9e.colibl21(de3)/prsfduet-bsgdh3.5实施例4根据文献characterisationofathiaminediphosphate-dependentalpha-ketoaciddecarboxylasefromproteusmirabilisjn458.foodchemistry,2017,232,19–24.在谷氨酸生长α-酮戊二酸的过程中，α-酮酸脱羧酶不能将α-酮戊二酸的羧基脱去。而且大肠杆菌中的乙醇脱氢酶也不具备还原α-酮戊二酸的能力。根据文献报道，谷氨酸脱氢酶不具备催化l-赖氨酸的能力，nad-glutamatedehydrogenasefromhalobacteriumhalobium:inhibitionandactivationbytcaintermediatesandaminoacids，biochimicaetbiophysicaacta,1289(1996)14-24。实施例5根据文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法将escherichiacolibl21(de3)上的hpad和mhpb进行单或双敲除。其中，本发明所用基因敲除的质粒为pcasred与pcrispr-gdna(hpadsgrna)与同源臂(hpaddonor)一起导入escherichiacolibl21(de3)上，cas9/sgrna诱发宿主在hpad基因位点发生双链断裂，重组酶red将hpaddonor整合到hpad基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpadsgrna、hpaddonor、mhpbsgrna、mhpbdonor分别如序列表seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12所示。mhpb以同样的方式敲除。配置ph为7的溶液，l-酪氨酸或酪醇4g/l，湿菌体量200g/l，35℃放置10小时后测定浓度，表4中显示了反应体系中l-酪氨酸和酪醇的剩余量。表4不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度e.colibl21(δhpadδmhpb,de3)效果最好，将之命名为e.colihm。实施例6重组大肠杆菌构建：首先将编码l-α-氨基酸转氨酶、l-谷氨酸脱氢酶，α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶，分别连接到prsfduet-1、pcdfduet-1质粒上。得到两个基因共表达重组质粒，将双质粒转化大肠杆菌e.colihm，利用抗生素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为40g/l，l-酪氨酸浓度为40g/l，l-谷氨酸浓度为30g/l，ph8.0，于35℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定酪醇，结果如表5所示。表5各种重组菌的比较实施例7采用文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法，将escherichiacolihm基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:8所示。强化基因glts表达时，以e.colihm基因组为模板，以引物glts-ff/glts-fr、glts-gpda-f/glts-gpda-r、glts-rf/glts-rr，扩增出上游、启动子、下游序列，并以glts-ff和glts-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含gltssgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在glts基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到glts基因之前，并测序验证。下表6为引物名称与序列表序号的对应索引。表6引物名称与序列表序号对照名称序列编号gltssgrnaseqidno:20glts-ffseqidno:21glts-frseqidno:22glts-gpda-fseqidno:23glts-gpda-rseqidno:24glts-rfseqidno:25glts-rrseqidno:26根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重5g/l，l-谷氨酸1g/l，l-酪氨酸20g/l，ph8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。表7转化结果比较将效果最好的e.colihm(pg-glts)命名为e.colihmg。实施例8根据实例7的方法将e.colihmg中nada、pdxj基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:8所示。然后再将质粒导入。强化基因nada表达时，以e.colihmg基因组为模板，以引物nada-ff/nada-fr、nada-gpda-f/nada-gpda-r、nada-rf/nada-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以nada-ff和nada-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含nadasgrna)一起转入e.colihmg后，cas9/sgrna诱发宿主在nada基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到nada基因之前，并测序验证。强化基因pdxj表达时，以e.colihmg基因组为模板，以引物pdxj-ff/pdxj-fr、pdxj-gpda-f/pdxj-gpda-r、pdxj-rf/pdxj-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以pdxj-ff和pdxj-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含pdxjsgrna)一起转入escherichiacolihmg后，cas9/sgrna诱发宿主在pdxj基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到pdxj基因之前，并测序验证。下表8为引物名称与序列表序号的对应索引。表8引物名称与序列表序号对照名称序列编号pdxjsgrnaseqidno:13nadasgrnaseqidno:1pdxj-ffseqidno:14pdxj-frseqidno:15pdxj-gpda-fseqidno:16pdxj-gpda-rseqidno:17pdxj-rfseqidno:18pdxj-rrseqidno:19nada-ffseqidno:2nada-frseqidno:3nada-gpda-fseqidno:4nada-gpda-rseqidno:5nada-rfseqidno:6nada-rrseqidno:7基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表9所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/l，l-谷氨酸200g/l，l-酪氨酸120g/l，ph9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。表9转化结果比较将最好的e.colihmg(pg-nada,pg-pdxj)命名为e.colihnp。实施例9根据实施例2所述诱导表达方法，将e.colihnp/(prsfduet-lcaro-bsgdh,pcdfduet-pmkdc-ecadh2)诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/l，l-谷氨酸1g/l，l-酪氨酸1g/l，ph6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，酪醇浓度为105mg/l。实施例10根据实施例2所述诱导表达方法，将表9中菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/l，l-谷氨酸20g/l，l-酪氨酸200g/l，ph8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解后测定结果，测定结果如表10所示。表10测定结果比较以上所述的l-α-氨基酸转氨酶、l-谷氨酸基因、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶及其共表达基因工程菌的构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均就包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>江南大学<120>一种工程菌及其在酪醇生产中的应用<160>50<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ttaacggcgtcggcttcggg20<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<400>2tcgaatcctgcacgacccaccacta25<210>3<211>50<212>dna<213>人工序列<400>3tcggccactcatcaacatgattcatcgacattagcgtaatattcgctgtt50<210>4<211>50<212>dna<213>人工序列<400>4aacagcgaatattacgctaatgtcgatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>5<211>50<212>dna<213>人工序列<400>5tgtctggatcaaacattacgctcatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>6<211>50<212>dna<213>人工序列<400>6cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgagcgtaatgtttgatccagaca50<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7catccacggacaatgcgcgcagctg25<210>8<211>1100<212>dna<213>人工序列<400>8atgaatcatgttgatgagtggccgatcgctacgtgggaagaaaccacgaaactccattgc60gcaatacgctgcgataaccagtaaaaagaccagccagtgaatgctgatttgtaaccttga120atatttattttccataacatttcctgctttaacataattttccgttaacataacgggctt180ttctcaaaatttcattaaatattgttcacccgttttcaggtaatgactccaacttattga240tagtgttttatgttcagataatgcccgatgactttgtcatgcagctccaccgattttgag300aacgacagcgacttccgtcccagccgtgccaggtgctgcctcagattcaggttatgccgc360tcaattcgctgcgtatatcgcttgctgattacgtgcagctttcccttcaggcgggattca420tacagcggccagccatccgtcatccatatcaccacgtcaaagggtgacagcaggctcata480agacgccccagcgtcgccatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaaccgtcttccgg540agcctgtcatacgcgtaaaacagccagcgctggcgcgatttagccccgacatagccccac600tgttcgtccatttccgcgcagacgatgacgtcactgcccggctgtatgcgcgaggttacc660gactgcggcctgagttttttaagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgc720gggcagttgcccggcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtac780cgggttgagaagcggtgtaagtgaactgcagttgccatgttttacggcagtgagagcaga840gatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccaccccgtcagtagctgaac900aggagggacagctgatagaaacagaagccactggagcacctcaaaaacaccatcatacac960taaatcagtaagttggcagcatcaccccgttttcagtacgttacgtttcactgtgagaat1020ggagattgcccatcccgccatcctggtctaagcctggaaaggatcaattttcatccgaac1080gttcctgacaggagaaaacc1100<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9tatgcccgtcgatcgcgccc20<210>10<211>120<212>dna<213>人工序列<400>10ccaagatcacgcacgtaccgtcgatgtatctctctgaactgccagggaaaaaccacggtt60agatcagcaagcgttgccgggaaatgggcgtcgataccattatcgttttcgacacccact120<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11tcatcgagtacctcttgcgc20<210>12<211>120<212>dna<213>人工序列<400>12tagcctgatatgcacgcttatcttcactgtctttcccactcgccgctggtgggatatgtc60aatggcgtgattgccagcgcccgcgagcgtattgcggctttctcccctgaactggtggtg120<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13cgtcgcggtcagtaatgtga20<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14gcagaagaagatggtcattggcaac25<210>15<211>50<212>dna<213>人工序列<400>15tcggccactcatcaacatgattcattcgcttaggcataaattgccggaac50<210>16<211>50<212>dna<213>人工序列<400>16gttccggcaatttatgcctaagcgaatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>17<211>50<212>dna<213>人工序列<400>17tgacgcctaacagtaattcagccatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>18<211>50<212>dna<213>人工序列<400>18cgaacgttcctgacaggagaaaaccatggctgaattactgttaggcgtca50<210>19<211>25<212>dna<213>人工序列<400>19tcacagcaaaacgcttcgccagaaa25<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20ttatggcttcaccaatgcga20<210>21<211>25<212>dna<213>人工序列<400>21taagggttacgttgacggttaagca25<210>22<211>50<212>dna<213>人工序列<400>22tcggccactcatcaacatgattcattgcttaaccgtcaacgtaaccctta50<210>23<211>50<212>dna<213>人工序列<400>23taagggttacgttgacggttaagcaatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>24<211>50<212>dna<213>人工序列<400>24ttgctaaagtatcgagatgaaacatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>25<211>50<212>dna<213>人工序列<400>25cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgtttcatctcgatactttagcaa50<210>26<211>25<212>dna<213>人工序列<400>26agccagctcccacagtttcagcccc25<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列<400>27atgacactatttagagacga20<210>28<211>18<212>dna<213>人工序列<400>28ttagttgatacagttagc18<210>29<211>21<212>dna<213>人工序列<400>29atgaagttgcaaccattaaat21<210>30<211>21<212>dna<213>人工序列<400>30ctaggcggctttatgcgcagc21<210>31<211>22<212>dna<213>人工序列<400>31atgtttgagaacattaccgccg22<210>32<211>21<212>dna<213>人工序列<400>32cagcactgccacaa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