糖苷水解酶家族61蛋白基因及其蛋白和制备方法与流程

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及糖苷水解酶家族61蛋白基因及其蛋白和制备方法。

背景技术：

纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分，也是目前地球上含量最丰富的可再生性资源。目前，纤维素的利用率还非常低，如何提高纤维素的利用率仍是一个世界级的课题。纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素产生葡萄糖。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，它们是分解纤维素的最重要的酶源。

随着石油和煤炭资源的日渐枯竭，如何更为有效地转化和利用纤维素这一自然界分布最广、最丰富也最廉价的可再生性有机资源和多糖物质，是我国关注的重要研究领域。所以利用纤维素酶降解纤维素，使其转化成燃料、食物和化学制品，如糖，乙醇，饲料蛋白等，对缓解能源危机，食品和饲料资源紧张有重大的经济意义，纤维素酶将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等领域中发挥重要作用。目前虽然发现产纤维素酶的生物群种很多，如细菌、真菌、放线菌及昆虫、软体动物等，但是随着纤维素酶在工、农、畜和医等领域都有广泛的需求，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。而我国的纤维素酶工业制备还处于研究开发阶段，纤维素酶的生产还存在纤维素酶活力较低，生产成本较高，生产周期较长等问题使得纤维素酶的应用受到限制。其中纤维素酶对纤维素的水解效率低下是纤维素乙醇(由木质纤维素转化生成的燃料乙醇)工业化生产的主要瓶颈之一，也是备受关注的重要课题。除提高纤维素酶的本身活性外，一些具有促进纤维素酶活性的蛋白逐渐进入人们的视野，如gh61糖苷水解酶家族蛋白，gh61家族蛋白具有微弱的内切葡聚糖酶活性，所以起初一直被作为糖苷水解酶。后来发现gh61蛋白并不是传统意义上的糖苷水解酶，gh61蛋白的三维结构与糖苷水解酶有所不同，它在扩展的平面上有个重要的β折叠，中心包含一个被认为是与金属离子结合的n-末端的组氨酸。进一步的研究表明gh61家族蛋白属于氧化酶，可以通过氧化反应使得纤维素被部分氧化降解，并在一定程度上破坏其结晶结构，从而使纤维素更容易被纤维素酶降解。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种糖苷水解酶家族61蛋白基因。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.糖苷水解酶家族61蛋白基因，所述糖苷水解酶家族61蛋白基因核苷酸序列如seqidno.1所示。

核苷酸序列seqidno.1由1524个脱氧核苷酸组成，本序列为成熟茯苓糖苷水解酶家族61蛋白(gh61)的全长cdna读码框。

本发明的目的在于还提供一种糖苷水解酶家族61蛋白基因编码的蛋白质。

2.一种如seqidno.1所示糖苷水解酶家族61蛋白基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示，包含651个核苷酸残基。

3.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为seqidno.1所示的糖苷水解酶家族61蛋白基因。

进一步，所述空载体为pet26载体。

4.一种重组菌，所述重组菌为包含目的基因如seqidno.1所示的重组载体转化的重组菌。

本发明的目的在于还提供一种糖苷水解酶家族61蛋白的制备方法。

5.糖苷水解酶家族61蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的基因重组到构建到载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；

2)将步骤1)表达株在lb液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mm的iptg诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的糖苷水解酶家族61蛋白。

进一步，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含10-50mm咪唑的ph8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mm～200mm咪唑的ph8.0缓冲液溶液将重组蛋白洗脱下来即可。

进一步，洗脱液为含200mm咪唑的ph8.0缓冲液溶液。

进一步，还可以将洗脱的蛋白液进行浓缩。

进一步，浓缩的方法为将蛋白液在分子截留量为15kd的超滤浓缩管浓缩。

进一步，浓缩的方法为将蛋白液在分子截留量为15kd的透析袋中用分子量大于10000的peg包埋浓缩。

进一步，浓缩的方法为将蛋白液进行冷冻干燥浓缩。

6.糖苷水解酶家族61蛋白在制备葡萄糖中的应用。

进一步，所述蛋白质将纤维素分解为葡萄糖的酶制剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明设计出一种新的能表达糖苷水解酶家族61蛋白的基因序列，进一步利用pet26载体构建出重组质粒并转化到大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物的可溶性表达，得到大量可溶形式的重组糖苷水解酶家族61蛋白；由本发明提供的蛋白制备及其纯化的方法，可以得到浓度较高且纯度为95％的重组糖苷水解酶家族61蛋白，所制备出来的蛋白有水解羧甲基纤维素钠(cmc-na)产生葡萄糖的酶活性，由本发明所制备的蛋白是单一的纤维素酶，属于糖苷水解酶家族61酶，可以按照不同应用将其和其他种类的纤维素酶进行搭配使用，以更优化的方式来使用，如和一种或多种β-葡糖苷酶或纤维素内切酶联合使用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明实施例中的pet26/gh61载体构建示意图。

图2为本发明实施例中的含有pet26/gh61载体重组载体表达的目标蛋白的sds-page检测结果图。

图3为本发明实施例中的纯化前后重组糖苷水解酶家族61蛋白的sds-page检测结果图。

图4为本发明实施例中的浓缩后的重组糖苷水解酶家族61蛋白的sds-page检测结果图。

图5为本发明对比例中样品的sds-page检测结果图。

图6为本发明实施例中重组蛋白酶活性检测的hplc结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株top10和表达载体pet26均购自美国invritrogen公司。

所用培养基配方和试剂配方如下：

1)lb液体培养基：nacl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1l，高压灭菌，室温保存；

2)lb/amp平板：nacl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1l，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1ml浓度为100mg/ml的卡那霉素(kan)，充分混均后倒板，4℃避光保存；

3)lb/kan培养基：nacl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1l，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mlkan(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；lb液体培养基：nacl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1l，高压灭菌，室温保存。

4)50×tae琼脂糖凝胶电泳缓冲液：tris碱121g，冰乙酸26.6ml，0.5mol/ledta(ph8.0)50ml，加蒸馏水定容至500ml，室温保存；

5)50mg/ml卡那霉素保存液：卡那霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10ml，分装后于-20℃保存；

6)5×sds-page上样缓冲液：1mtris-hcl(ph6.8)1.25ml，sds0.5g，bpb25mg，甘油2.5ml，加去离子水溶解后定容至5ml，分装(约500μl每份)后于室温保存，使用每份加入25μlβ-巯基乙醇混匀；

7)5×sds-page电泳缓冲液：tris15.1g，甘氨酸94g，sds5.0g，加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解后定容至1l，室温保存；

8)考马斯亮蓝r-250染色液：考马斯亮蓝r-2500.25g，加入225ml甲醇、46ml的冰乙酸、225ml去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50ml，甲醇150ml，去离子水300ml，充分混合后，室温保存。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的糖苷水解酶家族61蛋白基因，具体序列如序列表中的seqidno.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的seqidno.2所示。本发明提供的序列在ncbi数据库中无相似度达70％的序列，它是根据大肠杆菌表达的特点如密码子的偏好性、防止出现复杂的dna结构以免影响转录效率、保证合理的gc含量、选择合适的酶切位点、理想的表达标签及终止信号等特点人工优化并合成的众多序列中的一种dna序列。本发明所述的序列及与本序列高度同源的dna序列在大肠杆菌中均有较其它序列更高的可溶性目标蛋白的表达。

将上述优化后的基因连接到大肠杆菌表达载体pet26中并获得重组载体，以上经测序验证无误的重组载体热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性lb平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中pet26/gh61载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pet26/gh61载体构建示意图。

利用经优化的天然纤维素内切酶基因序列的pet26重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.1-0.5mm的iptg在18℃下诱导均检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白sds-page结果如图2所示，重组糖苷水解酶家族61蛋白分子量为26kda左右，表达的目标蛋白如箭头所示。

s1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工合成经优化的成熟糖苷水解酶家族61蛋白基因，将该合成的基因连接至puc通用载体得到puc/gh61，利用bamhi和hindiii双酶切puc/gh61，将得到的gh61片段再亚克隆至表达载体pet26中并连接至表达载体pet26中，得到重组表达载体pet26/gh61，载体构建如图1所示。主要的载体构建步骤如下：

(1)用bamhi和hindiii双酶切载体puc/gh61，获得目的片断gh61，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连takara公司)：

(2)用bamhi和hindiii双酶切pet26，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连takara公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用dna凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连takara公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用t4dna连接酶(购自大连takara公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：

将重组载体pet26/gh61转化到大肠杆菌top10菌株中，再从top10中提取重组载体pet26/gh61；用热激法将重组载体pet26/gh61转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有kan抗性的lb平板筛选得到包含有重组载体pet26/gh61的大肠杆菌表达菌株转化子。

实施例2

本实施例提供一种制备gh61活性蛋白的方法，具体包括如下步骤：

1)可溶性重组糖苷水解酶家族61蛋白的表达与提取：将实施例1筛选得到的包含有重组载体pet26/gh61的大肠杆菌表达菌株转化子在37℃的液体lb培养基中培养至od600为0.4，然后分别加入浓度为0、0.1、0.2和0.5mm的iptg，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300w，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，得到重组糖苷水解酶家族61蛋白，sds-page结果如图2所示。

2)重组糖苷水解酶家族61蛋白的纯化：将pet26/gh61载体的大肠杆菌重组转化子在液体lb培养基中扩大培养，再在18℃下用0.1mmiptg诱导20-24小时，收集经iptg诱导表达后的表达菌的菌体，将菌体重悬于50ml的缓冲液a(含20mmna2hpo4，200mmnacl，10mm咪唑和1mm蛋白酶抑制剂pmsf，ph8.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300w，破碎2s，间隙6s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min；本实施例采用的pet26表达载体的n-端已包含一个his×6标签，因此表达的目标蛋白可以利用镍亲合层析柱进行纯化。将离心所得到的上清液加入到经缓冲液a预平衡的镍亲合层析柱中；用100ml缓冲液b(含20mmna2hpo4，200mmnacl，10mm咪唑ph8.0)漂洗蛋白纯化柱子后，分别依次加入包括浓度为50mm、100mm、200mm或400mm咪唑的缓冲液c(含20mmna2hpo4，200mmnacl，ph8.0)，将蛋白洗脱下来，其中200mm咪唑洗脱的蛋白是纯度在95％以上的重组糖苷水解酶家族61蛋白，具体结果如图3所示。

3)重组糖苷水解酶家族61蛋白的浓缩：将蛋白质样品在ph4.0的20mmna2hpo4和柠檬酸缓冲液下透析，透析结束后，利用截留分子量为15kda的超滤管进行超滤浓缩即可得到纯度在95％以上的高浓度重组糖苷水解酶家族61蛋白，结果如图4所示。利用胶扫描并结合bradford法对目标蛋白的浓度进行了检测，表1是100ml经iptg诱导的菌体中可溶性纤维素内切酶重组蛋白经各纯化步骤的得率与纯度结果。

表1蛋白纯化结果

或者将蛋白液在分子截留量为15kd的透析袋中用分子量大于10000的peg包埋浓缩。

或者将将蛋白液进行冷冻干燥浓缩。

需要说明的是，在步骤1)得到的上清液中加入sds-page样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃温度下iptg的浓度为0.1、0.2和0.5mm时，都可以得到可溶性重组糖苷水解酶家族61蛋白。为节约成本，缩短生产周期，本发明优选采用诱导温度18℃，0.1mm的iptg进行诱导表达。

对比例

茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。木材的主要成分是纤维素。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的分泌型纤维素酶。利用转录组技术对茯苓的纤维素酶分解酶的表达谱进行分析发现了该高丰度的天然内切酶基因的cdna序列。利用转录组得到的数据，设计引物，经rt-pcr扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因序列如序列3所示，将该天然的茯苓重组糖苷水解酶家族61蛋白基因用bamhi和hindiii双酶切，并连接到同样经bamhi和hindiii双酶切的pet26表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性lb平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pet26/gh61载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体lb培养基中培养至od600为0.4，然后分别加入浓度为0、0.1、0.2、0.5mm的iptg，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300w，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，未得到可溶性重组糖苷水解酶家族61蛋白，sds-page结果如图5所示。该对比例结果说明，只有人工优化后的茯苓重组糖苷水解酶家族61蛋白基因才能在大肠杆菌中实现可溶性的表达。

实施例3

本发明利用高效液相色谱检测羧甲基纤维素钠(cmc-na)被内切酶水解产生少量葡萄糖的能力来确定酶活。具体方法如下：将纯化的重组糖苷水解酶家族61蛋白500μg加到ph4的含1％的cmc-na溶液中，40℃下反应4小时；反应结束后，将样品用0.22μm微孔滤膜过滤至样品瓶，供液相色谱分析。液相的方法如下：色谱柱：aglient氨基柱，250×4.6mm，5μm；流动相：乙腈：水＝70：30(体积比)，流速：1.0ml/min，进样量：10ul，柱温：35℃，检测器：示差折光检测器。hplc结果如图6所示，其中上图a为cmc-na在不加该重组纤维素内切酶的情况下未检测到葡萄糖峰，下图b为cmc-na加入本发明制备的纤维素内切酶反应4小时后，检测到了明显的葡萄糖峰，该峰的保留时间为6.453分钟，葡萄糖浓度约为87ng/μl，说明该内切酶的确具有水解纤维素产生葡萄糖的能力。检测到了明显的葡萄糖峰，说明该糖苷水解酶家族61蛋白具有水解纤维素产生葡萄糖的能力。

因此，根据以上结果，本发明所制备糖苷水解酶家族61蛋白是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的新颖重组纤维素内切酶。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>怀化学院

<120>糖苷水解酶家族61蛋白基因及其蛋白和制备方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>651

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cattatacctttccggatttcattgttggtagcaccgttagcaccgattggcagtatatt60

cgtgaaaccgcaaatcattattcaaatggtccggttaccagcgttaccgatccggaattt120

cgttgttatgaactggatctgcagaataccgcaggtcagaccagcaccgcaagcgttagc180

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ccgagcaactttaccggctatcaggcacctggtccggcagtttggcagggt651

<210>2

<211>217

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

histyrthrpheproasppheilevalglyserthrvalserthrasp

151015

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202530

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<211>651

<212>dna

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