多潜能干细胞诱导获得脊髓GABA能中间神经元的方法与流程

本发明涉及医药技术领域，具体指多潜能干细胞诱导获得脊髓gaba能中间神经元的方法。

背景技术：

脊髓损伤是常见的创伤性疾病，引起一系列的运动和心理问题，常见于30岁以下的人群。据统计，全球每年新增250,000至500,000例脊髓损伤患者，我国目前还未有全国范围内的统计，但从各地方性的统计来看，我国的脊髓损伤发病率远高于欧美国家。据美国2013年统计发现，脊髓损伤影响近100万人的生活质量，且每年医疗花费近400亿(armour,b.s.,courtney-long,e.a.,fox,m.h.,fredine,h.,andcahill,a.(2016).prevalenceandcausesofparalysis-unitedstates,2013.am.j.publichealth106,1855–1857)。其中将近40％～50％的患者在1年内继发出现神经病理性疼痛，并在后期转化为慢性疼痛，影响患者的恢复(jaymmargolis,pauljuneau,alesiasadosky,josephccappelleri,thomasnbryce,edwardcnieshoff.healthcareutilizationandexpendituresamongmedicaidbeneficiarieswithneuropathicpainfollowingspinalcordinjury.journalofpainresearch.2014:7379–387)。

癌痛是恶性肿瘤患者最常见且最痛苦的症状之一。约70％～87％的患者在癌瘤发展过程中有不同程度的疼痛,而肝癌、胰腺癌、骨肉瘤患者更是在疾病早期就有疼痛发生。仅中国每年就有100多万患者遭受癌性疼痛的折磨。中晚期患者以疼痛为主诉者高达60％～90％,严重降低了患者的生存质量。由于疼痛的加剧和强烈刺激直接影响患者的食欲、睡眠、心理状况和治疗效果，恶性肿瘤患者常常会失去治疗信心和生存欲望(zhangj.analgesiamechanismandclinicalapplicationofacupuncture.beijing:people'smedicalpublishinghouse.2007:522.chinese.liqs,qianh.cancercomplicationsanditsmanagement.in:tangzy.modernoncology.shanghai:shanghaimedicaluniversitypress.2000:556.chinese)。模拟中枢神经损伤的经典模型如脊髓损伤以及癌痛模型均在不同程度上存在脊髓水平gaba能神经元的缺失和功能障碍，从而引起痛觉传导通路的“脱抑制”现象，最终诱发痛觉过敏以及痛觉超敏等异常表现。

目前临床上对于疼痛的治疗主要有药物治疗和物理因子治疗，但药物治疗的全身副作用明显，而物理因子治疗的缓解期短，都达不到理想的治疗效果，需要寻求新的治疗方法。近年来，国内外学者纷纷聚焦于干细胞的新型治疗，取得了重大进展，但依然存在许多问题，比如，移植入体内的细胞不能精确地与宿主细胞形成突触连接，影响细胞在体内发挥作用。目前国内外干细胞治疗疾病引起的疼痛的研究中，并没有移入有针对性类型的细胞(youngs.gwak*,clairee.hulsebosch；gabaandcentralneuropathicpainfollowingspinalcordinjury；neuropharmacology60(2011)799e808)。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出了利用多潜能干细胞定向分化为高纯度的脊髓gaba能中间神经元，用于治疗各种疾病引发的疼痛。

本发明所述多潜能干细胞诱导获得脊髓gaba能中间神经元的方法包括：

步骤(1)多潜能干细胞在chir99021、sb431542和dmh1的作用下分化得到神经上皮细胞；

步骤(2)加入环巴胺和视黄酸进行持续诱导分化，得到脊髓神经前体细胞；

步骤(3)经消化处理后，继续在环巴胺和视黄酸的作用下进行分化，得到脊髓gaba能中间神经元；以及，

步骤(4)经消化处理后，将所述脊髓gaba能中间神经元进行贴壁培养使其成熟。

进一步地，所述chir99021、sb431542和dmh1的摩尔浓度比为3:2:2。

进一步地，所述环巴胺和视黄酸的摩尔浓度比为5:1。

进一步地，所述步骤(4)的培养时间为3～4周。

进一步地，步骤(1)～步骤(4)中所需细胞培养液均由临床级别的培养基和临床级别的添加剂制备得到。

本发明还提供了前述方法制备所得脊髓gaba能中间神经元在制备药物中的用途，所述药物用于治疗疼痛。

本发明的目的在于提供利拉鲁肽在制备治疗急慢性移植排斥反应药物中的应用，为移植排斥的治疗提供一种新的药品。

进一步地，所述疼痛由脊髓损伤或恶性肿瘤引发。

治疗前一天，将待移植的神经球消化成单个细胞，计数。于移植当天制成细胞悬液，所述细胞悬液包含neurabasal、neaa、b27、aa、n2、bdnf、gdnf、camp。

本发明所述多潜能干细胞诱导获得脊髓gaba能中间神经元还可用于细胞联合治疗，比如细胞移植联合电针治疗、细胞移植联合磁刺激疗法。

本发明的有益效果：

本发明所述多潜能干细胞诱导获得脊髓gaba能中间神经元的方法可以快速高效地得到高纯度的脊髓gaba能中间神经元，并且避免了外源性因素的干扰。

附图说明

图1为本发明实施例1中多潜能干细胞分化为脊髓gaba能中间神经元的流程图；

图2-a为本发明实施例1中人多潜能干细胞分化至第7天所得神经上皮细胞的sox1免疫组化图，图2-b为本发明实施例1中人多潜能干细胞分化至第7天出现的神经上皮细胞的hoxa3免疫组化图；

图3-a为本发明实施例1中人多潜能干细胞分化至第14天所得脊髓中间神经元前体细胞的olig2免疫荧光图，图3-b为本发明实施例1中人多潜能干细胞分化至第14天所得脊髓中间神经元前体细胞的hoxb4免疫荧光图；

图4-a为本发明实施例1中人多潜能干细胞分化至第21天所得脊髓gaba能中间神经元的gaba免疫荧光图，图4-b为本发明实施例1中人多潜能干细胞分化至第21天所得脊髓gaba能中间神经元的nf-200免疫荧光图；图4-c为本发明实施例1中人多潜能干细胞分化至第21天所得脊髓gaba能中间神经元的gad65/67免疫荧光图；图4-d为本发明实施例1中人多潜能干细胞分化至第21天所得脊髓gaba能中间神经元的tuj1免疫荧光图。

具体实施方式

以下结合附图详细说明本发明的实施情况，但它们不构成对本发明的限定，仅作举例而已。同时通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

本发明所述多潜能干细胞诱导获得脊髓gaba能中间神经元的方法包括四个步骤：

本发明所述多潜能干细胞诱导获得脊髓gaba能中间神经元的方法使用的培养液全部为无动物源性的，得到的gaba能中间神经元是临床级别的，可用于临床研究及未来的临床治疗。

该方法采用单层细胞诱导方法，使用chir99021、sb431542与dmh1获得管状的神经上皮细胞后，加入cyclopamine(环巴胺)和retinoicacid(视黄酸)进行诱导，最终获得脊髓来源的gaba能中间神经元，用于治疗各种疾病引发的疼痛。

图1为本方法的具体培养流程和培养各阶段的标志物检测。图中，d0、d7、d14和d21分别表示培养的第0天、第7天、第14天和第21天，psc代表多潜能干细胞；nep代表神经上皮细胞；scnp代表脊髓中间神经元前体细胞；3c代表chir99021、sb431542与dmh1三种化学小分子；5c代表chir99021、sb431542、dmh1、cyclopamine和retinoicacid五种小分子。

实施例1高纯度的脊髓gaba能中间神经元的制备

复苏mef(小鼠成纤维细胞)

取出冻存管，于37度水浴锅内震荡融化(1-2min)，当有少量冰块剩余时停止，用移液枪将冻存液吸取到已加有5mlmef培养基的15ml离心管中，1000转，5min,离心。取出0.1％明胶铺过夜的六孔板，用移液枪吸取剩余明胶，将mef按3x10⁵/孔铺到六孔板上。

ipsc传代

配制50mlipsc培养基，于50ml离心管内加入39mldf-12、500μlneaa、500μlglutamax、10mlksr、0.35μlβ-巯基乙醇、20μlbfgf，吹打混匀。1mg/mldispaseⅱ消化酶于37℃消化3min，在显微镜下观察ipsc克隆周围卷边时停止消化，df-122ml洗两遍，加入2mlipsc培养基吹下克隆，1000转，2minl离心，按合适的比例将细胞铺到mef饲养层细胞上。

d0，ⅰ阶段，ipsc分化成为神经上皮细胞

培养基配制，将24.5mldf-12、24.5mlneurobasal加入到50ml离心管中，后加入500μlneaa、500μln2、100μlsb431542、150μlchir99021、100μldmh1，吹打混匀。用移液枪吸取原ipsc培养基，加入2mlⅰ阶段培养基，隔天换液，直到第7天。

d7，ⅱ阶段，将神经上皮细胞分化为脊髓前体细胞

培养基配制，将24.5mldf-12、24.5mlneurobasal加入到50ml离心管中，后加入500μlneaa、500μln2、1mlb27、100μlsb431542、50μlchir99021、100μldmh1、5μlra、25μlcyclopamine。铺mef(重复第一步骤)用移液枪吸取六孔板里的原培养基，df-12洗两遍，加入ⅱ阶段培养基，用1ml移液枪吹下克隆，按合适的比例(1:8)将细胞铺到mef饲养层细胞上，每孔培养基加至2ml，每天半换液，直到第14天。

d14，ⅲ阶段，悬浮阶段

培养基配制，将24.5mldf-12、24.5mlneurobasal加入到50ml离心管中，后加入500μlneaa、500μln2、1mlb27、5μlra、25μlcyclopamine。用移液枪吸取六孔板里的原培养基，df-12洗两遍，加入ⅲ阶段培养基，用1ml移液枪吹下克隆，按合适比例(2:1)将细胞悬浮液移入t25培养瓶中，培养基加至10ml。每天用1ml移液枪吹打神经球，防止粘连，隔天半换液，直至第21天。

d20

取一24孔板，每孔放入无菌的圆玻片，每孔加入0.1mg/mlpll至整个圆玻片被铺满,置于37度过夜。消化神经球，用移液枪将t25培养瓶里的神经球悬浮液吸至15ml离心管，1000转，3min，弃上清，加入accutaes2ml置于37度消化5min，至神经球变小，加入4mldf-12终止消化，1000转，3min，弃上清。加入5mlⅲ阶段培养基混匀，移入t25培养瓶中继续培养。

d21

吸取24孔板里的pll，用无菌水洗三遍，晾干24孔板(一般6h为宜)。将浓度为20ng/mllaminin铺满整个圆玻片，置入37度培养2h。配制ⅳ阶段培养基，用移液枪将48mlneurobasal加入50ml离心管中，后加入500μlneaa、500μln2、1mlb27、10μlcamp、10μlbdnf、10μlgdnf、10μlaa，吹打混匀。用移液枪将t25培养瓶里的神经球悬浮液吸至15ml离心管，1000转，3min，弃上清。加入100μlⅳ阶段培养基，吹打混匀，将100μl悬浮液滴入10cm培养皿正中间，用10μl移液枪吸取神经球按合适密度种入铺有laminin的24孔板里。置入37度培养箱2h后，至显微镜下观察神经球已贴壁，加入ⅳ阶段培养基至500μl。培养3-4周。

实施例2培养各阶段的标志物的检测

对分化第7天出现的神经上皮细胞进行sox1和hoxa3免疫组化染色，得到如图2所示的神经上皮细胞鉴定图，其中sox1是神经上皮细胞的标志物、hoxa3是脊髓颈段的标志物。

同样地，对分化至第14天出现的脊髓中间神经元前体细胞进行olig2和hoxb4免疫荧光染色，得到如图3所示的脊髓中间神经元前体细胞鉴定图，其中olig2是脊髓腹侧的标志物、hoxb4是脊髓的标志物。

而对分化至21天出现的脊髓gaba能中间神经元进行gaba、nf-200、gad65/67和tuj1免疫荧光染色，则可以得到如图4所示的脊髓gaba能中间神经元鉴定图，其中gaba是gaba神经元的标志物、nf-200是神经元细胞骨架的标志物、gad65/67是gaba神经元的特异性标志物、tuj1为神经元的标志物。

实验结果证明，通过本实施例所述方法可以快速高效地获得高纯度脊髓gaba能中间神经元。