农杆菌介导的甜椒遗传转化方法与流程

本发明涉及一种农杆菌介导的甜椒遗传转化方法。

背景技术：

随着生命科学的蓬勃发展，分子生物学和基因工程也取得了长足的进步。根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导的外源基因转化方法，由于其可导入大片段dna且导入基因拷贝数低，高转化率且表达效果好，引起了人们的极大关注，同时由于其对仪器和操作技术要求较低，被广泛应用植物基因工程中，用于研究未知基因功能，各种基因调控原件的机理等。目前，已知的80％的转基因植物是通过农杆菌介导完成的。

甜椒(学名：capsicumannuumvar.grossum)俗称灯笼椒、柿子椒、甜椒，中国台湾话也称作大筒仔，是茄科辣椒属辣椒的一个变种，分布于中国大陆的南北各地，属于“非人工引种栽培”类型植物。

利用农杆菌介导的甜椒转基因尚未有文献报道。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的甜椒遗传转化方法，用于填补现有技术中的空白。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种根癌农杆菌介导的甜椒遗传转化方法，所述方法至少包括以下步骤：

(1)提供甜椒外植体；

(2)提供含有目的基因的根癌农杆菌，侵染甜椒外植体3～7min，共培养36～72h，共培养时采用暗培养，培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为3～5mg·l^-1，α-萘乙酸的浓度为0.15～0.25mg·l^-1，乙酰丁香酮的浓度为小于200mmol/l；

(3)选择培养；培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为3～5mg·l^-1，α-萘乙酸的浓度为0.15～0.25mg·l^-1，卡那霉素(kanamycinkan)浓度为45～75mg·l^-1，头孢菌素的浓度为300～500mg·l^-1；

(4)生芽培养：培养基中卡那霉素(kanamycinkan)浓度为45～75mg·l^-1，6-苄氨基嘌呤的浓度为3～5mg·l^-1，α-萘乙酸的浓度为0.15～0.25mg·l^-1，浓度为300～500mg·l^-1头孢菌素的或者浓度为100～300mg·l^-1的特美汀；

(5)生根培养：培养基中α-萘乙酸的浓度为3～5mg·l^-1，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.15～0.25mg·l^-1，浓度为300～500mg·l^-1头孢菌素的或者浓度为100～300mg·l^-1的特美汀。

进一步地，所述甜椒外植体可以通过现有技术培养也可以通过市购获得。

利用现有技术培养甜椒外植体操作方法为：将甜椒种子侵泡、冲洗、消毒、在培养基上接种培养。培养条件可以是23～26℃，16h/d光照培养，6～12d后得到未长出子叶，带有子叶节的无菌苗。切去子叶节作为遗传转化的外植体。

根癌农杆菌agrobacteriumtumefaciens

特美汀为复方制剂，其组分为：替卡西林钠与克拉维酸钾。

进一步地，所述步骤(1)中甜椒外植体采用子叶节顶端的分生组织。

进一步地，所述方法中使用的全部培养基的ph为5.6～6.0。更优选为5.8。

进一步地，所述方法中使用的培养基都为ms培养基。ms培养基可以市购，例如上海伊卡尔生物技术有限公司ek180112(货号)。

进一步的，所述步骤(1)还包括对甜椒外植体经过预培养。

更进一步地，所述预培养采用的培养基是ms培养基，暗培养，培养时间36-72h，温度23-26℃。

进一步地，所述步骤(2)中温度23～26℃，暗培养，时间36～72h，优选条件为温度25℃，培养时间48h。

进一步地，所述步骤(3)中温度23～26℃，光照条件1500～2200lux，14-18h/d，时间10～17d，优选条件为温度25℃，光照条件2000lux，16h/d，培养时间15d。

进一步地，所述步骤(4)中温度23～26℃，光照强度1500～2200lux，14-18h/d，时间10～17d，优选条件为温度25℃，光照条件2000lux，16h/d，培养时间15d。

进一步地，所述步骤(5)中温度23～26℃，光照强度1500～2200lux，14-18h/d，时间10～17d，优选条件为温度25℃，光照条件2000lux，16h/d，培养时间15d。

进一步地，所述头孢菌素选自头孢噻吩钠(cef)、氨苄青霉素(amp)、羧苄青霉素(carb)、红霉素(e)、头孢曲松钠(ceftriaxonesodium)中的任意一种或几种。更优选为头孢噻吩钠。

如上所述，本发明的根癌农杆菌介导的甜椒遗传转化方法，具有以下有益效果：

采用本方法对甜椒进行遗传转化，效率高。

附图说明

图1显示为实施例1共培养时照片。

图2显示为实施例1选择培养后生成愈伤组织的照片。

图3显示为实施例1生芽培养时愈伤组织发芽的照片。

图4显示为实施例1生根培养时照片。

图5显示为实施例1移植后的照片。

图6显示为实施例1叶片表达绿色荧光的照片。

图7显示为实施例1叶片表达绿色荧光的另外一张照片。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

表1材料来源

愈伤诱导率(％)＝(产生愈伤的外植体数/总外植体数)×100％；

平均每个愈伤组织抗性芽数＝抗性芽数总数/愈伤组织总数。

质粒(1301gfp)中的目的基因通过农杆菌导入甜椒细胞后，可以使甜椒表达绿色荧光蛋白。

以下实施例中培养基的ph都为5.8。

实施例1

表2各培养基组分

1、甜椒外植体的制备

将甜椒种子用水浸泡9h，流水清洗30min，用无菌水冲洗4次，然后于超净工作台上用75％酒精消毒1min，再用20％的“84”和0.02％的tritonx-1001:1混合液，180rpm震荡消毒10min，无菌水冲洗4～6次。将消毒除菌的甜椒种子置于表2中获取外植体培养基(ms)中，25℃，16h/d光照培养，6d后得到未长出子叶，带有子叶节的无菌苗。切取甜椒子叶节作为遗传转化的外植体。

2、预培养

将甜椒外植体置于表2中预培养培养基(ms)中培养，置于25℃，暗培养2天。外植体切口处膨大。

3、侵染

预先配置固体和液体lb培养基，保存于4℃冰箱。将含有目的基因的农杆菌(含质粒(1301gfp)的根癌农杆菌gv3101)划线接种于含有50mg·l^-1rif+50mg·l^-1kan的lb培养基上，28℃暗培养2d至长出单菌落。随后挑取单菌落转接至含有100mg·l^-1kan+50mg·l^-1rif的5ml液体lb培养基中，200r/min，28℃条件下培养16h后，转接至含有50mg·l^-1rif+100mg·l^-1kan的50ml液体培养基中，继续培养至对数生长期od600≌0.6～1.0，5000r/min集菌，使用侵染缓冲液将其悬浮之od600≌0.3～0.6，并加入as浓度为100μmol·l^-1，暗培养2h。

使用制备好的农杆菌侵染缓冲液侵染预培养的甜椒外植体，具体方法为：先将外植体取出，放置于灭菌的滤纸上，再将所有外植体放入侵染缓冲液中，侵染时间为5min。使用灭菌的滤纸尽量将外植体上的菌液吸干，随后进行共培养。

4、共培养

将侵染后的甜椒外植体置于表2中共培养培养基(ms+0.2mg/lnaa+4mg/l6-ba+100μmol/las)进行共培养，培养条件为25℃，暗培养2d。部分外植体切口处出现少量褐化区域，且培养基表面出现农杆菌菌斑。如图1。

5、选择培养

将甜椒外植体置于表2中选择培养基(ms+0.2mg/lnaa+4mg/l6-ba+50mg/lkan+400mg/lcef(200mg/ltimentin))进行培养。培养条件为25℃，光照16h/d，时间15d。外植体褐化死亡现象出现，随继代次数增加，褐化现象减少，外植体成功生成黄绿色愈伤。如图2。

6、生芽培养

将甜椒外植体置于表2中生芽培养基(ms+0.2mg/lnaa+4mg/l6-ba+50mg/lkan+400mg/lcef(200mg/ltimentin))进行培养至不定芽生长至1～2cm。培养条件为25℃，光照16h/d，时间15d。少量愈伤组织出现褐化，愈伤组织成功生出黄绿色再生芽体。如图3。

7、生根培养

将甜椒外植体置于表2中生根培养基(ms+0.2mg/l6-ba+4mg/lnaa+400mg/lcef(200mg/ltimentin))进行培养。培养条件为25℃，光照16h/d，时间7～8d。愈伤组织生根较为细长，且生长迅速，再生芽提快速生长，生成叶片，且叶片呈墨绿色。如图4。移植后正常存活，如图5。图6和图7分别为培养一段时间后表达绿色荧光的照片。

实验结果：外植体正常产生愈伤并生根，且植株生长迅速，叶片呈墨绿色，具体结果如表3。

表3

实施例2

表4各培养基组分

1、甜椒外植体的制备

将甜椒种子用水浸泡9h，流水清洗30min，用无菌水冲洗4次，然后于超净工作台上用75％酒精消毒1min，再用20％的“84”和0.02％的tritonx-1001:1混合液，180rpm震荡消毒10min，无菌水冲洗4～6次。将消毒除菌的甜椒种子置于表3中获取外植体培养基(1/2ms)中，23℃，1800lux,14h/d光照培养，8d后得到未长出子叶，带有子叶节的无菌苗。切取甜椒子叶节作为遗传转化的外植体。

2、预培养

将甜椒外植体置于表4中预培养培养基(ms)中培养，置于23℃，暗培养72h。外植体切口处膨大。

3、侵染

预先配置固体和液体lb培养基，保存于4℃冰箱。将含有目的基因的农杆菌(含质粒(1301gfp)的根癌农杆菌gv3101)划线接种于含有50mg·l^-1rif+50mg·l-1kan的lb培养基上，28℃暗培养2d至长出单菌落。随后挑取单菌落转接至含有100mg·l^-1kan+50mg·l^-1rif的5ml液体lb培养基中，200r/min，28℃条件下培养16h后，转接至含有50mg·l^-1rif+100mg·l^-1kan的50ml液体培养基中，继续培养至对数生长期od600≌0.6～1.0，5000r/min集菌，使用侵染缓冲液将其悬浮之od600≌0.3～0.6，并加入as浓度为150μmol·l^-1，暗培养2h。

使用制备好的农杆菌侵染缓冲液侵染预培养的甜椒外植体，具体方法为：先将外植体取出，放置于灭菌的滤纸上，再将所有外植体放入侵染缓冲液中，侵染时间为3min。使用灭菌的滤纸尽量将外植体上的菌液吸干，随后进行共培养。

4、共培养

将侵染后的甜椒外植体置于表4中共培养培养基(ms+0.25mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+150μmol/las)进行共培养，培养条件为23℃，暗培养72h。部分外植体切口处出现褐化区域，且外植体周围均出现农杆菌菌斑。

5、选择培养

将甜椒外植体置于表4中选择培养基(ms+0.25mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+55mg/lkan+500mg/lcef(300mg/ltimentin))进行培养。培养条件为23℃，光照1800lux,16h/d，时间17d。外植体褐化死亡现象出现，随继代次数增加，外植体成功生成黄绿色愈伤，但仍存在部分褐化现象。

6、生芽培养

将甜椒外植体置于表4中生芽培养基(ms+0.25mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+55mg/lkan+500mg/lcef(300mg/ltimentin))进行培养至不定芽生长至1～2cm。培养条件为23℃，光照1800lux,16h/d，时间17d。少量愈伤组织出现褐化，愈伤组织成功生出黄绿色再生芽体。

7、生根培养

将甜椒外植体置于表4中生根培养基(ms+0.25mg/l6-ba+4.5mg/lnaa+500mg/lcef(300mg/ltimentin))进行培养。培养条件为23℃，光照1800lux,14h/d时间9～10d。愈伤组织生根较为细长，且生长迅速，再生芽体快速生长，生成叶片，且叶片呈黄绿色。

移植后正常存活。

实验结果：

外植体正常产生愈伤并生根，且植株生长迅速，叶片呈墨绿色，具体如表5。

表5

实施例3

表6各培养基组分

1、甜椒外植体的制备

将甜椒种子用水浸泡9h，流水清洗30min，用无菌水冲洗4次，然后于超净工作台上用75％酒精消毒1min，再用20％的“84”和0.02％的tritonx-1001:1混合液，180rpm震荡消毒10min，无菌水冲洗4～6次。将消毒除菌的甜椒种子置于表4中获取外植体培养基(ms)中，26℃,18h/d,2200lux光照培养，6d后得到未长出子叶，带有子叶节的无菌苗。切取甜椒子叶节作为遗传转化的外植体。

2、预培养

将甜椒外植体置于表6中预培养培养基(ms)中培养，置于26℃，暗培养36h。外植体切口处膨大。

3、侵染

预先配置固体和液体lb培养基，保存于4℃冰箱。将含有目的基因的农杆菌(含质粒(1301gfp)的根癌农杆菌gv3101)划线接种于含有50mg·l^-1rif+50mg·l-1kan的lb培养基上，28℃暗培养2d至长出单菌落。随后挑取单菌落转接至含有100mg·l^-1kan+50mg·l^-1rif的5ml液体lb培养基中，200r/min，28℃条件下培养16h后，转接至含有50mg·l^-1rif+100mg·l^-1kan的50ml液体培养基中，继续培养至对数生长期od600≌0.6～1.0，5000r/min集菌，使用侵染缓冲液将其悬浮之od600≌0.3～0.6，并加入as浓度为50μmol·l^-1，暗培养2h。

使用制备好的农杆菌侵染缓冲液侵染预培养的甜椒外植体，具体方法为：先将外植体取出，放置于灭菌的滤纸上，再将所有外植体放入侵染缓冲液中，侵染时间为7min。使用灭菌的滤纸尽量将外植体上的菌液吸干，随后进行共培养。

4、共培养

将侵染后的甜椒外植体置于表6中共培养培养基(ms+0.25mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+50μmol/las)进行共培养，培养条件为26℃，暗培养36h。部分外植体切口处出现褐化区域，外植体周围出现少量农杆菌菌斑。

5、选择培养

将甜椒外植体置于表6中选择培养基(ms+0.15mg/lnaa+3mg/l6-ba+45mg/lkan+300mg/lcef(100mg/ltimentin))进行培养。培养条件为26℃，光照18h/d，2200lux,时间14d。外植体褐化速度较快，且外植体出现褐化死亡现象出现，需缩短继代时间间隔，随继代次数增加，褐化现象减少，外植体成功生成黄绿色愈伤。

6、生芽培养

将甜椒外植体置于表6中生芽培养基(ms+0.15mg/lnaa+3mg/l6-ba+45mg/lkan+300mg/lcef(100mg/ltimentin))进行培养至不定芽生长至1～2cm。培养条件为26℃，光照18h/d，2200lux,时间14d。愈伤组织出现褐化，生芽速度较快，愈伤组织成功生出黄绿色再生芽体。

7、生根培养

将甜椒外植体置于表6中生根培养基(ms+0.15mg/l6-ba+3mg/lnaa+300mg/lcef(100mg/ltimentin))进行培养。培养条件为26℃，光照18h/d，2200lux,时间5～8d。愈伤组织生根较为短粗，且生长迅速，再生芽体快速生长，生成叶片，且叶片呈墨绿色。如图4。移植后正常存活。

实验结果：

外植体正常产生愈伤并生根，且植株生长迅速，叶片呈墨绿色，具体结果如表7。

表7

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。