一种MYCT-１基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种myct-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法。

背景技术：

myct-1基因广泛表达与多种正常组织，且在胃癌、喉癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中存在表达降低现象的基因，是一种潜在的抑癌基因。目前，myct-1基因功能及其在肿瘤发生中的可能机制，仍然不是很明确。现有技术中也没有关于myct-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法的描述，本发明创新的提出了一种高效的myct-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供myct-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：一种myct-1基因慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤一，myct-1基因片段的克隆，根据myct-1基因设计引物序列，并在引物序列中引入了交换配对碱基和酶切位点，通过pcr法扩增myct-1基因片段，扩增条件为：94℃5-8min，94℃20-50s，55℃30-40s，72℃1-5min，进行25-35个循环后，72℃延伸6-12min，得到myct-1基因克隆片段；

步骤二，myct-1基因慢病毒表达载体的构建，将步骤一得到的myct-1基因克隆片段与经酶切线性化的gv218载体按照(1:3)-(1:9)的摩尔比混合，先在20-30℃条件下反应20-40min，然后在40-45℃条件下反应15-20min，进行定向连接得到克隆交换液，将克隆交换液转化至大肠杆菌感受态细胞，得到转化的感受态细胞，然后将转化的感受态细胞转移至lb琼脂培养基上35-40℃培养12-20h，设计鉴定引物，通过pcr法进行扩增，将阳性克隆进行测序并进行结果比对，筛选得到myct-1基因慢病毒表达载体。

优选地，所述步骤一中引物序列包括上游引物seqidno:1和下游引物seqidno:2。

优选地，所述步骤二中鉴定引物包括ubi-f(seqidno:3)和egfp-n-r(seqidno:4)。

本发明的另一个目的是提供一种myct-1基因慢病毒表达载体的鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一，将myct-1基因慢病毒表达载体转染至293t细胞，24h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，筛选得到转染293t细胞，收集转染293t细胞细胞并提取蛋白，采用westernblot方法检测转染293t细胞样品中myct-1基因慢病毒表达载体融合蛋白的表达情况,筛选得到myct-1基因慢病毒表达载体融合蛋白过表达的myct-1基因慢病毒表达载体；

步骤二，将步骤一种得到的myct-1基因慢病毒表达载体融合蛋白过表达的myct-1基因慢病毒表达载体及其两种辅助包装原件载体质粒

phelper1.0和phelper2.0，分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染至293t细胞，转染后5-8h转移至完全培养基，培养30-48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293t细胞中以实时荧光定量pcr法进行滴度测定并标定病毒滴度，从而鉴定myct-1基因慢病毒表达载体。

本发明的有益效果，采用myct-1基因克隆片段与经酶切线性化的gv218载体按照(1:3)-(1:9)的摩尔比混合，提高了myct-1基因慢病毒表达载体构建成功效率；采用westernblot方法检测转染293t细胞样品中myct-1基因慢病毒表达载体融合蛋白的表达情况，并用实时荧光定量pcr法进行滴度测定并标定病毒滴度，能够准确的鉴定myct-1基因慢病毒表达载体，并得到高滴度的myct-1基因慢病毒表达载体。

附图说明

图1为本发明实施例myct-1基因扩增产物凝胶电泳结果图；

图2为本发明实施例gv218-myct-1过表达质粒慢病毒的阳性克隆pcr鉴定结果图；

图3为本发明实施例质粒转染293t细胞24h荧光表达情况图；

图4为本发明实施例westernblot质粒转染293t细胞样品图；

图5为本发明实施例不同浓度病毒感染后样品组的ct值及表达量分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

实施例1

1材料与方法

1.1材料慢病毒载体系统和慢病毒的包装细胞293t细胞(上海吉凯基因化学技术有限公司)；dntp(takara)；琼脂糖(赛百盛公司)；质粒抽提试剂盒(promega公司)；taq酶(sino－bio公司)；胎牛血清fbs(上海微科生化试剂有限公司)；dm－so(上海生物试剂厂)；dmem(gibco公司)；胰酶(上海化学试剂公司)；台盼蓝(上海捷倍思基因技术)；lipofectamine2000(invitrogen公司)；限制性内切酶(neb公司)。

1.2方法

1.2.myct-1基因片段的克隆，引物序列中引入了交换配对碱基和酶切位点，通过pcr法扩增目的基因片段，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，进行30个循环后，72℃延伸10min。

1.2.2myct-1基因重组慢病毒载体构建，将获得的基因片段与经酶切线性化的gv218载体以1∶3～1∶9的摩尔比加入反应体系进行定向连接，于25℃反应30min后于42℃反应15min制备克隆交换液，将产物转化至大肠杆菌感受态细胞，最后将已转化的感受态细胞转移至lb琼脂培养基上，37℃培养16h。将阳性克隆菌液送公司测序并进行结果比对。

1.2.3gv218－myct－1慢病毒过表达质粒蛋白表达检测将gv218－myct－1慢病毒过表达质粒转染293t细胞，24h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。收集细胞，提取蛋白，westernblot方法检测转染293t细胞样品中myct－1－gfp融合蛋白的表达。

1.2.4病毒包装、纯化及滴度测定将编码慢病毒颗粒的重组gv218－myct－1质粒及其两种辅助包装原件载体质粒

phelper1.0和phelper2.0，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按invitrogen公司lipofectamine2000使用说明进行共转染293t细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293t细胞中以实时荧光定量pcr法进行滴度测定并标定病毒滴度。

2结果

2.1myct-1基因扩增产物凝胶电泳结果获得约751bp大小

pcr产物，见图1。

2.2gv218－myct－1过表达质粒慢病毒的阳性克隆鉴定阳性转化子pcr产物大小为912bp，阴性转化子pcr产物大小为198bp，见图2，测序结果与目标序列比对完全一致。

2.3gv218－myct－1重组质粒293t细胞蛋白表达转染后，细胞内可观察到明显的荧光，说明目的质粒转染正常、目的质粒荧光标记基因表达正常，见图3。转染293t的样品经westernblot检测，可以观察到52×103附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻合，见图4。在本次滴度检测中，1×10－4μl组样品和对照组样品的ct值存在2个左右差异，认为在1×10－4μl组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为2×108tu/ml，见图5。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<120>一种myct-１基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法

<141>2018-10-04

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列()

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