核酸检测试纸、制备方法和检测方法与流程

本发明涉及一种生物试纸检测技术领域，特别是一种核酸检测试纸、制备方法和检测方法。

背景技术：

核酸检测是分子生物学领域的研究热点，已广泛应用于临床疾病检测、食品安全和环境污染等领域。传统的核酸检测方法(如pcr)存在操作过程复杂耗时，检测成本较高，需要专门的设备和专业的技术人员等缺点和局限性。近年来，纸基微流控检测技术发展迅速，并开始应用于核酸检测。利用纸基微流控技术进行核酸检测操作简单、检测快速、成本低廉且携带方便，受到人们的关注和重视。然而，目前基于核酸的纸基检测方法仍存在检测灵敏度不高的问题，难以达到临床检测要求，极大程度上限制了这种方法的应用和普及。因此，增强基于核酸的试纸检测信号，提高其检测灵敏度，对于促进该检测方法的实际应用，发挥其潜在应用价值具有十分重要的意义。

为增强侧流试纸检测信号，国内外学者进行了多方面的研究，包括增强显色颗粒的光学性质、减缓液体流速、转换显色信号等方法。例如，将纳米金显色颗粒结合或聚集到一起，形成较大的纳米金团聚体，增大试纸检测线的显色强度；在单个纳米金颗粒表面吸附金或银金属颗粒，从而增加单个纳米金颗粒的尺寸和光学强度，最终实现检测信号的提高；在单个纳米金颗粒表面修饰酶类，利用酶促反应产生的颜色变化增强检测信号。但这些方法实验过程较复杂，稳定性不高，难以应用于临床实践。增强侧流试纸检测信号的另一个方法是有效控制检测过程中液体的流速，已有学者通过改变试纸的几何形状、在试纸中增加疏水性障碍或改变试纸的亲疏水性等方法延缓液体流速，增加试剂的反应时间，增强试纸的检测信号。然而，这些方法大多制造过程复杂、批量生产差异大、稳定性不高。另外，研究者利用纳米金的光热效应将光信号转换成温度信号、利用上转换纳米颗粒在激发状态下发出的荧光来增强检测灵敏度，但这些方法均需要额外的检测或激发装置，不利于集成、生产和临床应用。

在背景技术部分中公开的上述信息仅仅用于增强对本发明背景的理解，因此可能包含不构成在本国中本领域普通技术人员公知的现有技术的信息。

技术实现要素：

为解决上述现有技术的不足之处，本发明提供一种核酸检测试纸、制备方法和检测方法，显著提高其检测灵敏度，操作简单，成本低廉，适用性强，达到快速、高效、便捷检测的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现。

本发明的一个方面，一种核酸检测试纸包括，

支撑垫，

结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在所述支撑垫上，结合垫与检测垫部分重合，吸水垫与检测垫部分重合，

对照区，其经由对照探针溶液加载在检测垫上形成，

检测区，其经由捕获探针溶液加载在检测垫上形成，

可溶盐柱，设在检测垫上的固态可溶盐柱位于结合垫和检测区之间，可溶盐柱经由盐溶液在检测垫加热蒸发以在其孔隙中析出盐结晶形成。

所述的核酸检测试纸中，所述结合垫中包含检测探针-显色颗粒复合物，所述检测探针-显色颗粒复合物经由显色颗粒胶体溶液与检测探针溶液混合反应形成。

所述的核酸检测试纸中，所述检测探针溶液由检测探针粉末、醋酸缓冲液、tcep和超纯水组成，对照探针溶液由对照探针粉末、链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇组成，捕获探针溶液由捕获探针粉末、链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇组成，所述盐溶液包括ssc缓冲液、氯化钠溶液、柠檬酸钠溶液、醋酸钠溶液、pbs缓冲液和/或碳酸盐缓冲液。

所述的核酸检测试纸中，所述ssc缓冲液包括氯化钠和柠檬酸钠。

所述的核酸检测试纸中，所述检测垫包括硝酸纤维素膜，显色颗粒胶体溶液为纳米金胶体溶液，所述纳米金颗粒粒径为13nm。

所述的核酸检测试纸中，结合垫与检测垫重合2mm，吸水垫与检测垫重合2mm。

根据本发明的另一方面，一种核酸检测试纸的制备方法包括以下步骤：

第一步骤，制备空白试纸条，结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在所述支撑垫上，结合垫与检测垫部分重合，吸水垫与检测垫部分重合，然后将其裁剪成空白试纸条；

第二步骤，制备显色颗粒胶体溶液，将显色颗粒胶体溶液与检测探针溶液混合反应形成检测探针-显色颗粒复合物，探针-显色颗粒复合物加载到所述空白试纸条的结合垫上；

第三步骤，对照探针溶液加载在空白试纸条的检测垫上形成对照区，

第四步骤，捕获探针溶液加载在空白试纸条的检测垫上形成检测区，

第五步骤，在检测垫上位于结合垫和检测区之间的位置加载盐溶液，加热蒸发以在其孔隙中析出盐结晶形成可溶盐柱。

所述的核酸检测试纸的制备方法中，所述检测探针溶液由检测探针粉末、醋酸缓冲液、tcep和超纯水组成，对照探针溶液由对照探针粉末、链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇组成，捕获探针溶液由捕获探针粉末、链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇组成，所述盐溶液包括ssc缓冲液、氯化钠溶液、柠檬酸钠溶液、醋酸钠溶液、pbs缓冲液和/或碳酸盐缓冲液。

所述的核酸检测试纸的制备方法中，第五步骤，在硝酸纤维素膜上位于结合垫和检测区之间的位置滴加盐溶液，盐溶液渗透硝酸纤维素膜并填充到纤维孔隙中，形成充满盐溶液的柱形区域，其在37℃烘干箱烘干1～3h，盐溶液中的水分蒸发且在硝酸纤维素膜上形成固态的可溶盐柱。

根据本发明的又一方面，一种利用所述核酸检测试纸的检测方法包括以下步骤：

第一步骤，目标物粉末加入ssc缓冲液以形成目标物溶液；

第二步骤，所述结合垫浸入目标物溶液预定时间，目标物溶液依次通过检测垫、可溶盐柱、检测区，最后被吸水垫吸收；

第三步骤，取出核酸检测试纸，观察对照区和检测区的显色情况，若对照区和检测区同时显色，表明结果为阳性；若检测区未显色，对照区显色，表明结果为阴性；若检测区和对照区均未显色，表明结果不可靠，需重复检测。

本发明具有以下有益效果：

利用盐溶液在试纸硝酸纤维素膜上形成可溶盐柱，在检测过程中通过减缓液体流速，增加反应时间以及加快核酸反应速率两方面的作用增强试纸的检测信号，提高检测灵敏度。该方法操作简单、成本低廉、稳定性好、应用广泛。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够使得本发明的技术手段更加清楚明白，达到本领域技术人员可依照说明书的内容予以实施的程度，并且为了能够让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，下面以本发明的具体实施方式进行举例说明。

附图说明

通过阅读下文优选的具体实施方式中的详细描述，本发明各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。说明书附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。而且在整个附图中，用相同的附图标记表示相同的部件。

在附图中：

图1是根据本发明一个实施例的核酸检测试纸的结构示意图；

图2是根据本发明一个实施例的核酸检测试纸的制备方法的步骤示意图；

图3是根据本发明一个实施例的核酸检测试纸的检测方法的步骤示意图；

图4(a)至图4(b)是根据本发明一个实施例的核酸检测试纸的检测结果图；

图5(a)至图5(b)是根据本发明一个实施例的核酸检测试纸的检测结果图。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的解释。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个附图并不构成对本发明实施例的限定。

为了更好地理解，图1是根据本发明一个实施例的核酸检测试纸的结构示意图，如图1所示，一种核酸检测试纸，其包括，

支撑垫4，

结合垫1、检测垫2、吸水垫3依次布置在所述支撑垫4上，结合垫1与检测垫2部分重合，吸水垫3与检测垫2部分重合，

对照区5，其经由对照探针溶液加载在检测垫2上形成，

检测区6，其经由捕获探针溶液加载在检测垫2上形成，

可溶盐柱7，设在检测垫2上的固态可溶盐柱7位于结合垫1和检测区6之间，可溶盐柱7经由盐溶液在检测垫2加热蒸发以在其孔隙中析出盐结晶形成。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述结合垫1包含检测探针-显色颗粒复合物，所述检测探针-显色颗粒复合物经由显色颗粒胶体溶液与检测探针溶液混合反应形成。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述检测探针溶液由检测探针粉末、醋酸缓冲液、tcep和超纯水组成，对照探针溶液由对照探针粉末、链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇组成，捕获探针溶液由捕获探针粉末、链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇组成，所述盐溶液包括ssc缓冲液、氯化钠溶液、柠檬酸钠溶液、醋酸钠溶液、pbs缓冲液和/或碳酸盐缓冲液。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，基于核酸的增强侧流试纸包括：结合垫(1)、硝酸纤维素膜(2)、吸水垫(3)和支撑垫(4)，其中结合垫(1)和吸水垫(3)均与硝酸纤维素膜(2)有部分重合，结合垫(1)用于装载显色颗粒，硝酸纤维素膜(2)上设有对照区域(5)和检测区域(6)。

本发明实施例中，硝酸纤维素膜(2)上设有可溶盐柱(7)：在试纸硝酸纤维素(2)上按一定滴加方式滴加盐溶液，然后将试纸放入37℃的烘干箱中烘干1～3h，盐溶液中的水分蒸发，在硝酸纤维素膜(2)的孔隙中析出盐结晶，形成固态可溶盐柱(7)；

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述ssc缓冲液主要成分为氯化钠和柠檬酸钠，浓缩倍数为0.5×～20×。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述氯化钠溶液的配制方法：称取一定量的氯化钠，加入超纯水定容至100ml，得到氯化钠溶液，浓度为0.01～1m。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述柠檬酸钠溶液的配制方法：称取一定量的柠檬酸钠，加入超纯水定容至100ml，得到柠檬酸钠溶液，浓度为0.01～1m。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述醋酸钠溶液的配制方法：称取一定量的醋酸钠，加入超纯水定容至100ml，得到醋酸钠溶液，浓度为0.01～1m。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述pbs缓冲液的主要成分为磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钠和氯化钾，浓缩倍数为0.1×～10×。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述碳酸盐缓冲液的配制方法为：称取一定量的碳酸钠和碳酸氢钠，加入超纯水定容至100ml，得到碳酸盐缓冲液，浓度为0.01～1m。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，滴加方式包括在硝酸纤维素膜(2)中央滴加一滴0.2～2μl的盐溶液，在硝酸纤维素膜(2)中央滴加两滴0.2～1μl的盐溶液，在硝酸纤维素膜(2)两侧边缘滴加两滴0.2～1μl的盐溶液。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，所述检测垫2包括硝酸纤维素膜，显色颗粒胶体溶液为纳米金胶体溶液，所述纳米金颗粒粒径为13nm。

本发明所述的核酸检测试纸的优选实施例中，结合垫1与检测垫2重合2mm，吸水垫3与检测垫2重合2mm。

图2是根据本发明一个实施例的核酸检测试纸的制备方法的步骤示意图，一种核酸检测试纸的制备方法包括以下步骤：

第一步骤s1，制备空白试纸条，结合垫1、检测垫2、吸水垫3依次布置在所述支撑垫4上，结合垫1与检测垫2部分重合，吸水垫3与检测垫2部分重合，然后将其裁剪成空白试纸条；

第二步骤s2，制备显色颗粒胶体溶液，将显色颗粒胶体溶液与检测探针溶液混合反应形成检测探针-显色颗粒复合物，探针-显色颗粒复合物加载到所述空白试纸条的结合垫1上；

第三步骤s3，对照探针溶液加载在空白试纸条的检测垫2上形成对照区5，

第四步骤s4，捕获探针溶液加载在空白试纸条的检测垫2上形成检测区6，

第五步骤s5，在检测垫2上位于结合垫1和检测区6之间的位置加载盐溶液，加热蒸发以在其孔隙中析出盐结晶形成可溶盐柱7。

所述的核酸检测试纸的制备方法的优选实施方式中，所述检测探针溶液由检测探针粉末、醋酸缓冲液、tcep和超纯水组成，对照探针溶液由对照探针粉末、链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇组成，捕获探针溶液由捕获探针粉末、链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇组成，所述盐溶液包括ssc缓冲液、氯化钠溶液、柠檬酸钠溶液、醋酸钠溶液、pbs缓冲液和/或碳酸盐缓冲液。

所述的核酸检测试纸的制备方法的优选实施方式中，第五步骤s5，在硝酸纤维素膜上位于结合垫1和检测区6之间的位置滴加盐溶液，盐溶液渗透硝酸纤维素膜并填充到纤维孔隙中，形成充满盐溶液的柱形区域，其在37℃烘干箱烘干1～3h，盐溶液中的水分蒸发且在硝酸纤维素膜上形成固态的可溶盐柱7。

在一个实施例中，一种增强基于核酸的试纸检测信号的方法包括以下步骤：

1)制备空白侧流试纸条，先将结合垫(1)、硝酸纤维素膜(2)、吸水垫(3)按一定顺序整合到支撑垫(4)上，结合垫(1)和吸水垫(3)与硝酸纤维素膜(2)均有2mm的重合；

2)制备粒径为13nm的纳米金胶体溶液，溶液呈酒红色，制备的纳米金颗粒可直接用于指示试纸的检测信号；

3)向目标物粉末中加入ssc4×缓冲液，将目标物配制成100μm浓度的溶液；向对照探针粉末和捕获探针粉末中依次加入一定配比的链霉亲和素溶液、pbs缓冲液和无水乙醇，分别获得100μm浓度的对照探针和捕获探针溶液；向检测探针粉末中加入一定配比醋酸缓冲液、tcep和超纯水，获得100μm浓度的检测探针溶液；将制备好的显色颗粒胶体溶液与检测探针充分混合反应，形成检测探针-显色颗粒复合物；

4)将对照探针溶液和捕获探针溶液加在试纸硝酸纤维素膜(2)上，形成对照区(5)与检测区(6)；将检测探针-显色颗粒复合物溶液加在试纸结合垫(1)上；

5)在试纸硝酸纤维素膜(2)上按一定滴加方式滴加盐溶液，盐溶液快速渗透到硝酸纤维素膜(2)中，然后将试纸放入37℃的烘干箱中烘干1～3h。随着盐溶液中的水分蒸发，盐结晶逐渐在硝酸纤维素膜(2)的孔隙中析出，形成固态可溶盐柱(7)；

所述盐溶液包括ssc缓冲液、氯化钠溶液、柠檬酸钠溶液、醋酸钠溶液、pbs缓冲液和碳酸盐缓冲液；

所述ssc缓冲液主要成分为氯化钠和柠檬酸钠，浓缩倍数为0.5×～20×；

所述氯化钠溶液的配制方法：称取一定量的氯化钠，加入超纯水定容至100ml，得到氯化钠溶液，浓度为0.01～1m；

所述柠檬酸钠溶液的配制方法：称取一定量的柠檬酸钠，加入超纯水定容至100ml，得到柠檬酸钠溶液，浓度为0.01～1m；

所述醋酸钠溶液的配制方法：称取一定量的醋酸钠，加入超纯水定容至100ml，得到醋酸钠溶液，浓度为0.01～1m；

所述pbs缓冲液的主要成分为磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钠和氯化钾，浓缩倍数为0.1×～10×；

所述碳酸盐缓冲液的配制方法为：称取一定量的碳酸钠和碳酸氢钠，加入超纯水定容至100ml，得到碳酸盐缓冲液，浓度为0.01～1m；

所述滴加方式包括在硝酸纤维素膜(2)中央滴加一滴0.2～2μl的盐溶液，在硝酸纤维素膜(2)中央滴加两滴0.2～1μl的盐溶液，在硝酸纤维素膜(2)两侧边缘滴加两滴0.2～1μl的盐溶液。

6)取烘干后的试纸条，将其结合垫(1)一端浸入80μl的目标物溶液中，15～25分钟后取出试纸，观察对照区(5)和检测区(6)的显色情况，若对照区(5)和检测区(6)同时显色，表明结果为阳性；若检测区(6)未显色，对照区(5)显色，表明结果为阴性；若检测区(6)和对照区(5)均未显色，表明结果不可靠，需重复检测。

图3是根据本发明一个实施例的核酸检测试纸的检测方法的步骤示意图，一种利用所述核酸检测试纸的检测方法包括以下步骤：

第一步骤s1，目标物粉末加入ssc缓冲液以形成目标物溶液；

第二步骤s2，所述结合垫1浸入目标物溶液预定时间，目标物溶液依次通过结合垫1、可溶盐柱7、检测区6，最后被吸水垫3吸收；

第三步骤s3，取出核酸检测试纸，观察对照区5和检测区6的显色情况，若对照区5和检测区6同时显色，表明结果为阳性；若检测区6未显色，对照区5显色，表明结果为阴性；若检测区6和对照区5均未显色，表明结果不可靠，需重复检测。

为了进一步理解本发明，在一个实施例中，一种增强基于核酸的试纸检测信号的步骤包括：

第一步骤s1中，制备传统侧流试纸条：将结合垫1、硝酸纤维素膜2和吸水垫3按一定顺序整合到支撑垫4上；将对照探针溶液和捕获探针溶液加在试纸硝酸纤维素膜2上，形成对照区5与检测区6；将检测探针-显色颗粒复合物溶液加在试纸结合垫1上；

第二步骤s2中，在试纸上滴加盐溶液，得到增强侧流试纸：在试纸硝酸纤维素膜2上按一定方式滴加盐溶液，形成可溶盐柱7，得到增强侧流试纸；

具体步骤及原理为：在试纸硝酸纤维素膜2上滴加盐溶液，盐溶液很快渗透硝酸纤维素膜2并填充到纤维孔隙中，形成一个充满盐溶液的柱形区域。检测前，将滴加有盐溶液的试纸放入37℃烘干箱烘干1～3h，盐溶液中的水分逐渐蒸发，最终在试纸的硝酸纤维素膜2上形成固态的可溶盐柱7。检测过程中，硝酸纤维素膜2上的盐柱给液体的流动造成了空间上的障碍，液体在溶解盐柱的过程中，流动受到限制和阻碍，流速明显减小，在硝酸纤维素膜2上的时间延长，增加了样品中目标物与显色颗粒、捕获探针之间的反应时间；更多的目标物与纳米金标记的检测探针相结合，同时会有更多的目标物被捕获探针捕获，因此可以增强试纸的检测信号。另一方面，随着盐柱的溶解，溶液中钠离子浓度升高，会加速核酸互补反应，最终提高检测灵敏度。

第三步骤s3中，用增强试纸进行核酸检测：取烘干后的试纸条，将其结合垫1一端浸入核酸目标物溶液中，15～25分钟后取出试纸，观察对照区5和检测区6的显色情况，若对照区5和检测区6同时显色，表明结果为阳性；若检测区6未显色，对照区5显色，表明结果为阴性；若检测区6和对照区5均未显色，表明结果不可靠，需重复检测。

在检测过程中，可溶盐柱7可以减缓液体流速、增加反应时间，同时溶解的na⁺可以加快核酸的反应速率。因此，调节加入盐溶液的浓度、滴加的图案和体积，可以实现对液体流动的调控，最终可以增强基于核酸的试纸检测信号，提高检测灵敏度。该方法操作简单、成本低廉、稳定性好，可为纸基微流控检测的临床应用提供指导。

下面例举具体的实施例进行说明：

实施例1：核酸检测

一种增强基于核酸的试纸检测信号的方法，包括以下步骤：

1制备空白侧流试纸条，首先将结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫整合到支撑垫上，其中硝酸纤维素膜设置在中间，结合垫设置在硝酸纤维素膜的一端，吸水垫设置在硝酸纤维素膜的另一端，结合垫和吸水垫均与硝酸纤维素膜有2mm的重合，然后将其裁成3mm宽的试纸条；

2选择显色颗粒为13nm的纳米金颗粒，由柠檬酸钠还原氯金酸的方法制得，用于指示试纸的检测信号；

3将目标物配制成溶液，浓度为100μm，并将其稀释为50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05nm的浓度梯度；将对照探针、捕获探针和检测探针分别配制成溶液，浓度为100μm；将制备好的显色颗粒与检测探针结合，形成检测探针-显色颗粒复合物；

4取对照探针溶液和捕获探针溶液各0.5μl，加在试纸硝酸纤维素膜上，形成对照区与检测区，两个区域间隔2mm；取检测探针-显色颗粒复合物溶液8μl，加在试纸结合垫上；

5在试纸硝酸纤维素膜上滴加一滴1μl的20×ssc缓冲液，ssc缓冲液渗透到硝酸纤维素膜中，在硝酸纤维素膜中形成一个充满盐溶液的柱形区域，然后将试纸放入37℃的烘干箱中烘干2h，ssc缓冲液中的水分蒸发，在硝酸纤维素膜的孔隙中留下其中的钠盐，形成固态可溶盐柱。

6取烘干后的试纸条，将其结合垫一端浸入80μl不同浓度的目标物溶液中，20分钟后取出试纸，观察对照区和检测区的显色情况，检测结果如图4(a)至图5(b)所示。与传统试纸相比，加ssc缓冲液改进后的试纸的显色强度有明显提高，传统的试纸的检测限为1nm，改进后的试纸的检测限为0.1nm，提高了10倍，说明通过该方法，试纸的检测信号得到增强，检测灵敏度提高。

实施例2：核酸检测

一种增强基于核酸的试纸检测信号的方法，包括以下步骤：

1制备空白侧向流试纸条，首先将结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫整合到支撑垫上，其中硝酸纤维素膜设置在中间，结合垫设置在硝酸纤维素膜的一端，吸水垫设置在硝酸纤维素膜的另一端，结合垫和吸水垫均与硝酸纤维素膜有2mm的重合，然后将其裁成3mm的试纸条；

2选择显色颗粒为13nm的纳米金颗粒，由柠檬酸钠还原氯金酸的方法制得，用于指示试纸的检测信号；3将目标物配制成溶液，浓度为100μm，并将其稀释为50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05nm的浓度梯度；将对照探针、捕获探针和检测探针分别配制成溶液，浓度为100μm；将制备好的显色颗粒与检测探针结合，形成检测探针-显色颗粒复合物；

4取对照探针溶液和捕获探针溶液各0.5μl，加在试纸硝酸纤维素膜上，形成对照区与检测区，两个区域间隔2mm；取检测探针-显色颗粒复合物溶液8μl，加在试纸结合垫上；

5取20×ssc缓冲液，将其稀释为16×，在试纸硝酸纤维素膜上滴加一滴1.5μl的16×ssc缓冲液，ssc缓冲液渗透到硝酸纤维素膜中，在硝酸纤维素膜中形成一个充满盐溶液的柱形区域，然后将试纸放入37℃的烘干箱中烘干2h，ssc缓冲液中的水分蒸发，在硝酸纤维素膜的孔隙中留下其中的钠盐，形成固态可溶盐柱。

6取烘干后的试纸条，将其结合垫一端浸入80μl不同浓度的目标物溶液中，20分钟后取出试纸，观察对照区和检测区的显色情况，检测结果如图5(a)至图5(b)所示。与实施例1的结果类似，加ssc缓冲液改进后的试纸的显色强度与传统试纸相比有明显提高，传统的试纸的检测限为1nm，改进后的试纸的检测限为0.1nm，提高了10倍，说明通过该方法，试纸的检测信号得到增强，检测灵敏度提高。

本发明充分利用可溶盐柱可以减缓液体流速、增加反应时间，同时溶解的na+可以加快核酸的反应速率，从而增强核酸检测试纸的灵敏度。该方法操作简单、成本低廉、稳定性好，可为纸基微流控检测的临床应用提供思路与指导。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。