姬松茸多肽及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种天然活性产物技术领域，特别是涉及一种姬松茸多肽及其制备方法和应用。

背景技术：

随着年龄的增长，我们的大脑功能也在衰退，反应力记忆力也会跟着下降。现代人的生活节奏快，加班熬夜成了常有的事，让自己的睡眠时间大大减少，处于长期缺觉的状态。如果长期的缺觉，对身体健康来说，就会存在一些健康隐患，如会影响大脑的功能，使反应力、记忆力以及判断力下降。

对于中老年人，特别是高血压、脑动脉硬化等疾病患者，其记忆能力有明显波动。还有某些疾病，如神经衰弱、抑郁症、脑动脉硬化、慢性鼻窦炎等均是导致记忆力减退的常见原因。睡眠质量的优劣也与记忆力有着密切联系，睡眠不好同样会影响记忆功能。众所周知的，吸烟对人的大脑有损害，随着吸烟者年龄增长可能导致其记忆力衰退；有饮酒嗜好者也会出现记忆力减退的现象。

国内外防治记忆力障碍或减退的药物有很多，如目前临床常用的奥拉西坦和吡拉西坦等，它们均是通过改善脑部代谢，来达到增强记忆，提高学习能力但目的。但是，这些化学药物或多或少都有人们接受不了的不良反应，而且目前仅用于脑损伤及引起的神经功能缺失、记忆与智能障碍的治疗，无法对普遍的记忆力下降人群用药。

目前国内外市场上也有一些健脑补脑的产品，但是大多数存在效果不佳或成份复杂的缺陷。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种姬松茸多肽的制备方法，该方法制备得到的姬松茸多肽有明显的生物活性，能够显著改善动物记忆障碍、提高学习能力。

一种姬松茸多肽的制备方法，包括以下步骤：

提取：取姬松茸子实体，加入水匀浆后超声提取，离心后取上清液；

盐析：往上述上清液中加入硫酸铵进行盐析沉淀，取沉淀物透析，得到的透析物；

纯化：将上述透析物以离子交换层析柱进行分离，得到粗提物，再以葡聚糖凝胶柱进行纯化，即得姬松茸多肽。

上述方法制备得到的姬松茸多肽有明显的生物活性，能够改善动物记忆障碍、提高学习能力。

在其中一个实施例中，所述提取步骤中，按照1g子实体：0.8-1.8ml水的量加入水，所述匀浆过程置于冰上匀浆；所述超声提取时间为0.5-1.5hr。将匀浆过程置于冰上，可有效避免多肽失活的问题。

在其中一个实施例中，所述盐析步骤中，所述硫酸铵的加入量为使溶液的硫酸铵饱和度为75-85％，沉淀12-36hr；所述透析使用截留分子量为3.5kd的透析袋透析8-12hr。上述硫酸铵饱和度是指以饱和硫酸铵溶液的饱和度为100％计，75-85％的硫酸铵饱和度即指硫酸铵含量为饱和硫酸铵溶液中硫酸铵的75-85％。将溶液的硫酸铵饱和度控制在上述范围，具有较好的沉淀效果。以上述方式透析，能够除去沉淀物中的盐分及小分子杂质并最大化保留活性成分。

在其中一个实施例中，所述离子交换层析柱为deae-32离子交换层析柱，所述葡聚糖凝胶柱为sephadexg-50凝胶柱。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，，离子交换层析柱分离的具体步骤为：所述离子交换层析柱的内径为2.5cm，先以tris盐酸缓冲液平衡层析柱，再以0.1mol/l的nacl溶液为洗脱液洗脱5个柱体积，弃去洗脱液，之后换0.3mol/l的nacl溶液洗脱，流速为1ml/min，收集10-65min的洗脱液，即得粗提物。上述tris盐酸缓冲液ph值优选7.5。

在其中一个实施例中，所述纯化步骤中，葡聚糖凝胶柱纯化的具体步骤为：所述葡聚糖凝胶柱的内径为1cm，以水为洗脱液，流速为1ml/min，收集20-50min的洗脱液，即得姬松茸多肽。

本发明还公开了上述的姬松茸多肽的制备方法制备得到的姬松茸多肽。

该姬松茸多肽有明显的生物活性，能够改善动物记忆障碍、提高学习能力。

本发明还公开了述的姬松茸多肽在制备用于改善记忆障碍和/或提高学习能力的药物或保健食品中的应用。

在其中一个实施例中，所述药物的剂型为口服液、硬胶囊、软胶囊、片剂、丸剂、滴丸剂、颗粒剂、散剂、蜜膏剂或露剂。上述剂型均可通过本领域的常规技术手段，加入适合的满足剂型要求的赋形剂制备得到。

在其中一个实施例中，所述保健食品的剂型为袋泡茶、酒剂或鲜汁剂。上述保健食品均可通过常规技术手段，将该组合物加入到适合的食品中，以该食品作为基质而制备得到。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种姬松茸多肽的制备方法，以其独特的提取工艺对姬松茸中的多肽类成分进行提取，且提取得到的姬松茸多肽可提高morris水迷宫，跳台和避暗测试中小鼠的学习记忆能力，与模型组相比具有显著性差异，即该姬松茸多肽能够改善动物记忆障碍、提高学习能力。

附图说明

图1为实施例中离子交换柱层析初分离时0.3mol/l的nacl溶液洗脱色谱图；

图2为实施例中sephadexg-50分离姬松茸子实体活性多肽色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

一种姬松茸多肽，通过以下方法制备得到：

1、提取。

取新鲜姬松茸子实体，洗净后，按照1g子实体：1ml水的量加入水，置于冰上匀浆；随后超声提取，超声功率是200w，时间时1hr，4000r/min离心后取上清液；取部分上清液，回收溶剂，得水提物。

2、盐析。

往上述上清液中加入固体硫酸铵进行盐析沉淀，使硫酸铵饱和度为80％；沉淀24h后4000r/min离心，取沉淀物，以截留分子量为3.5kd的透析袋透析8-12hr，冷冻干燥后得到的透析物；

3、纯化。

3.1离子交换层析分离。

将上述透析物以deae-32离子交换层析柱进行分离，具体步骤为：以内径为2.5cm的deae-32离子交换层析柱(规格：2.5cm*80cm)进行在线分离，先用tris盐酸缓冲液(ph＝7.5)平衡层析柱，将上述得到的姬松茸透析物300mg溶解至3ml蒸馏水溶液上柱，吸附平衡后，再以0.1mol/l的nacl溶液洗脱5个柱体积后换0.3mol/l的nacl溶液为洗脱液，流速为1ml/min，检测波长为220nm进行实时监控，可见3个吸收峰，0.3mol/l的nacl溶液洗脱色谱图如图1所示，分别收集10-65min，130-200min，500-560min的洗脱液，回收溶剂，得三种不同馏分的提取物，其中10-65min的馏分即为目标粗提物。

3.2葡聚糖凝胶柱纯化。

将上述目标粗提物再以葡聚糖凝胶柱进行纯化，具体步骤为：以内径为1cm的sephadexg-50凝胶柱(规格：1cm*80cm)进行在线纯化，先用tris盐酸缓冲液(ph＝7.5)平衡层析柱，将上述得到的姬松茸粗提物100mg溶解至1ml蒸馏水溶液上柱，吸附平衡后，再以蒸馏水为洗脱液，流速为1ml/min，检测波长为220nm进行实时监控，可见2个吸收峰，如图2所示，分别收集20-50min，50-90min的洗脱液，回收溶剂，得馏分的提取物，其中20-50min的馏分冷冻干燥后即为姬松茸多肽。

实验例1

建立d-gal小鼠学习记忆力障碍模型并进行受试品活性测试。

1、方法。

1.1分组及给药。

将icr小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组(吡拉西坦)及给药组，其中给药组包括：水提物组、沉淀物组、透析物组、130-200min馏分组、500-560min馏分组、粗提物组、50-90min馏分组、姬松茸多肽组，每组10只。

除空白组外，其他组小鼠每日固定时间注射d-gal300mg/kg，空白组小鼠注射相同剂量的生理盐水，阳性对照组同时每日灌胃800mg/kg的吡拉西坦，给药组每日灌胃800mg/kg受试药。为了进行实验干预，空白组、模型组每日灌胃等量蒸馏水，给药持续6w(持续42d)。连续给药35天，末次给药次日开始训练，历时7天，期间持续灌胃给药，每天一次。

1.2实验方法

1.2.1避暗实验(step-throughtest)

1)实验方法：第一天为训练阶段，第二天为测试阶段，期间持续灌胃给药。第一天，将小鼠放入明室，并记录小鼠5min内错误次数(进入暗室次数)。24hr后重作测验，记录5min内的错误次数与动物从明室进入暗室潜伏期。

2)统计方法：采用spss16.0统计软件对实验数据进行统计分析，最终结果由均数±标准差(x±s)形式表示，采用t检验进行组间比较。

3)实验结果：如下表所示。

表1.小鼠避暗实验情况

^#与空白组比较p＜0.05，^##与空白组比较p＜0.01

*与模型组比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01

通过上述结果，我们可以看出，与空白组比，姬松茸多肽组、粗提物组、透析物组小鼠第2天错误次数均明显减少(p＜0.05或p＜0.01)，并且，沉淀物组、水提物组组小鼠第2天错误次数也有显著减少、第2天潜伏期也明显减少(p＜0.05)。

而阳性对照组、130-200min馏分组、500-560min馏分组、50-90min馏分组、空白组小鼠的各项指标虽有改善，但是并无显著性差异。

1.2.2跳台实验(step-downtest)

1)实验方法：

第一天为训练阶段，第二天为测试阶段，期间持续灌胃给药。第一天将小鼠放入反应箱内，适应环境3min，然后将小鼠放到反应箱内，置于铜栅上，通36v的交流电，记录每只小鼠5min内错误次数，24hr重作测验，为记忆保持测试，记录每只小鼠5min内的错误总数和潜伏期(第一次跳下平台的时间)。

2)统计方法：采用spss16.0统计软件对实验数据进行统计分析，最终结果由均数±标准差形式表示，采用t检验进行组间比较。

3)实验结果：如下表所示。

表2.小鼠跳台实验情况

^#与空白组比较p＜0.05，^##与空白组比较p＜0.01

*与模型组比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01

通过上述结果，我们可以看出，通过上述结果，我们可以看出，与空白组比，姬松茸多肽组、粗提物组、透析物、组沉淀物组小鼠第2天错误次数均明显减少(p＜0.05或p＜0.01)，并且，水提物组、阳性对照组、空白组小鼠第2天错误次数也有显著减少、第2天潜伏期也明显减少(p＜0.05)。

而130-200min馏分组、500-560min馏分组、50-90min馏分组小鼠的各项指标虽有改善，但是并无显著性差异。

1.2.3morris水迷宫(morriswatermazetest，mwmt)

1)实验方法：

平台置于第一象限中间，前6天为定位导航实验，分别选取二、三、四象限边缘的中间为入水点，测定小鼠到达平台时间(上台时间)。小鼠实验时间限定为120s，若在120s内小鼠未到达平台，则将小鼠放在平台上停留10s，并将小鼠到达平台时间记为120s，若小鼠120s内到达平台，则将其拿走，即结束训练。

第7天进行空间搜索实验，撤去平台，测定120s内小鼠分别在平台区、目标区域(平台外扩大5cm为目标区域)、目标象限的游泳穿梭次数。

2)统计方法：采用spss16.0统计软件对实验数据进行统计分析，最终结果由均数±标准差形式表示，采用t检验进行组间比较。

3)实验结果：如下表所示。

表3.小鼠水迷宫上台潜伏期(s)

^#与空白组比较p＜0.05，^##与空白组比较p＜0.01

*与模型组比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01

表4.小鼠第七天水迷宫情况(s)

^#与空白组比较p＜0.05，^##与空白组比较p＜0.01

*与模型组比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01

通过上述结果，我们可以看出，与空白组比，姬松茸多肽组、粗提物组、透析物组阳性药组与模型组比较小鼠前6天上台时间均明显减少，穿越平台和目标区域的次数也明显增多(p＜0.05或p＜0.01)，并且，空白组、沉淀物组、水提物组组小鼠也有改善，而130-200min馏分组、500-560min馏分组、50-90min馏分组并无显著性差异。

实验例2

血清指标检测。

血清样本制备：上述行为学实验结束后，即末次给药24hr后，眼眶采血，分离血清，4℃下保存，5000rpm/min，离心10min，分离取血清，置于-80℃冻存待测。参照试剂盒说明检测血清中的cat，t-aoc，ros，mda含量。

(1)血清中cat检测：检测步骤参照试剂盒(南京建成生物制品研究所，a007-1)说明书测定，如下表所示。

(2)血清中t-aoc检测：检测步骤参照试剂盒(南京建成生物制品研究所，a015-2)说明书测定，如下表所示。

(3)血清中ros检测：检测步骤参照试剂盒(南京建成生物制品研究所，e004)说明书测定，如下表所示。

(4)血清中mda检测：检测步骤参照试剂盒(南京建成生物制品研究所，a003-1)说明书测定，如下表所示。

表5.血清指标检测

^#与空白组比较p＜0.05，^##与空白组比较p＜0.01

*与模型组比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01

通过上述结果，我们可以看出，姬松茸多肽组与模型组比较cat、t-aoc含量增高，ros、mda含量降低(p＜0.05或p＜0.01)，空白组和阳性药组虽有差异但并不明显(p＜0.05或p＜0.01)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。