一种受microRNA调控的重组溶瘤肠道病毒71型及应用的制作方法

文档序号：20684145发布日期：2020-05-08 18:40阅读：597来源：国知局

本发明涉及肿瘤学和病毒学领域。具体地说，涉及一种受mirna调控的重组溶瘤肠道病毒71型及应用。

背景技术：

肠道病毒71型(ev71)属于小rna病毒目(picornavirales)小rna病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus)。ev71的基因组为单股正链rna分子，长度约为7400nt。ev71侵染肿瘤细胞后，可在10h内完成病毒复制周期，并引起细胞裂解反应，释放具有感染性的子代病毒颗粒，起始新一轮的复制周期。

一些病毒可选择性感染肿瘤细胞，引起溶瘤反应，表现为肿瘤细胞的直接裂解或细胞凋亡等介导的肿瘤细胞死亡。溶瘤反应通常由下列两种机制介导：第一，病毒感染导致肿瘤细胞直接裂解，释放大量子代病毒粒子，进而感染临近的其它肿瘤细胞；第二，病毒基因编码的蛋白可诱导肿瘤细胞死亡(cancerj.,2012,18:69)。而自噬是一种进化上保守的胞内降解机制，其生物学功能是将细胞不需要的胞质组分转运至溶酶体进行降解，有助于捕获、清除入侵细胞的外来病原体。病毒感染肿瘤细胞会导致不同程度的宿主应激反应，引起细胞自噬。自噬反应参与胞质中病毒组分的降解和清除过程，发挥重要的抗病毒天然免疫效应(revmedvirol.，2009，19:359；natrevmicrobiol.,2018,16:341)。

非编码microrna(mirna)分子是细胞内源性的翻译后调控因子，通过与mrna分子3’-utr区域的互补序列结合，抑制蛋白质的翻译过程，降低靶基因的表达水平。mirna在调节组织发育、细胞增殖与分化、肿瘤生成中发挥重要作用。mirna的表达模式与特定组织或发育阶段密切相关，不同组织具有特征性的mirna表达谱。此外，不同的肿瘤组织也具有各自的mirna表达特性，如恶性胶质瘤组织中mir-7、let-7a和mir-124等表达受到抑制，而mir-196a和mir-296等表达水平上调。在正常神经组织中，mir-7和let-7a的表达水平则较高。

目前肠道病毒71型对肿瘤细胞的溶瘤活性尚无报道，本发明通过基因重组技术对病毒进行改造，构建对特定内源性mirna敏感，同时保持抗肿瘤活性的重组病毒，建立利用mirna调节溶瘤肠道病毒71型组织嗜性的方法，从而增强溶瘤病毒靶向性和安全性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种受mirna调控的重组溶瘤肠道病毒71型，所述的重组病毒为将在肿瘤中特异性低表达的mirna靶序列插入到肠道病毒71型中获得。

本发明的另一个目的是提供一种受mirna调控的重组溶瘤肠道病毒71型，所述的重组溶瘤肠道病毒71型为seqidno.3所示的多核苷酸。

本发明的另一个目的在于提供了重组溶瘤肠道病毒71型的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明的发明思路为：申请人发现肠道病毒71型具有溶瘤效果，基于mirna在正常组织和肿瘤组织差异表达的特点，申请人针对mirna的靶点，将在肿瘤中特异性低表达的mirna靶序列插入到肠道病毒71型中制备了重组溶瘤肠道病毒71型。

以上所述的方案中，优选的，是将人源mir124靶序列插入到肠道病毒71型中制备的重组溶瘤肠道病毒71型。

一种受mirna调控的重组溶瘤肠道病毒71型，所述的重组溶瘤肠道病毒71型为seqidno.3所示的多核苷酸。

重组溶瘤肠道病毒71型的应用，包括利用本发明的重组溶瘤肠道病毒71型为唯一有效成分或有效成分之一制备成溶瘤药物。

所述的溶瘤药物包括抑制为神经胶质瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、淋巴瘤或黑色素瘤的药物。

所述肠道病毒71型包括现有已报道的所有毒株，毒株包括a、b、c三个基因型，包括a亚型brcr标准株(genbank获取号u22521)，以及c4亚型ah1(genbank获取号gq994988)、hn1(genbank获取号gu196833)、hn2(genbank获取号gq994992)、cq1(genbank获取号gq994989)和cq2(genbank获取号gq994990)株。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明利用mirna在正常组织和肿瘤组织差异表达的特点，采用重组方法构建基因组中含有mirna靶序列的重组溶瘤肠道病毒71型，病毒在不表达mirna的肿瘤细胞内特异性复制，而在表达mirna的正常的细胞中则不能复制，增强了溶瘤肠道病毒病毒71型载体的安全性。本发明的重组溶瘤肠道病毒71型可用于对肿瘤的靶向性治疗。

因此，在mirna的组织特异性分布特点的相关研究基础上，我们可以利用肿瘤组织和正常组织中特定mirna的表达特性，有目的地对溶瘤病毒进行改造，调控病毒的组织嗜性，使其有条件地在肿瘤细胞中进行扩增，减少对正常组织的潜在毒性。

与构建重组病毒的其它方法相比，将小片段mirna靶序列插入病毒基因组的操作灵活性更强，对病毒自身复制能力的影响更小。肠道病毒基因组仅含有一个开放阅读框，编码单一多聚蛋白，因此在编码区进行基因序列的插入或缺失将导致缺陷病毒的产生。而在基因组两端非编码区插入短序列，则对肠道病毒的复制能力影响较小。此外，在侵入宿主细胞后，肠道病毒的单股正链rna基因组会迅速受到细胞质中mirna介导的负调控作用，病毒的复制能力将显著下降。kelly等在溶瘤病毒cva21上进行的组织嗜性研究表明，含有肌肉组织特异性mirna(mir-133和mir-206)靶序列的重组病毒，在保持溶瘤能力的基础上，在小鼠模型上引起急性肌炎等副作用的水平显著降低。因此，通过利用组织内源性mirna的负调节能力，可以对复制型肠道病毒的组织嗜性进行调控，从而提高溶瘤病毒治疗的安全性。

本发明通过基因重组技术对病毒进行改造，构建对特定内源性mirna敏感，同时保持抗肿瘤活性的重组病毒，建立利用mirna调节溶瘤肠道病毒71型组织嗜性的方法，从而增强溶瘤病毒靶向性和安全性。

附图说明

图1受mirna调控的重组溶瘤肠道病毒71型基因组示意图；

将3拷贝的mirna靶序列(mirt)插入至肠道病毒71型brcr株基因组5’utr区域，获得重组肠道病毒71型感染性克隆。

图2重组溶瘤肠道病毒71型的一步生长曲线示意图；

在肠道病毒71型基因组中插入mir124的靶序列(mir124t)或作为阴性对照的小杆线虫cel-mir-39靶序列(celtcon)，对重组病毒复制均没有显著影响。

图3mirnamimics调控重组溶瘤肠道病毒71型复制示意图；

其中a为不同浓度mir124mimics对重组溶瘤肠道病毒71型(ev71-mir124t)复制的影响，b为mir124mimics对重组肠道病毒71型感染引起vero细胞裂解反应的影响，c为mir124mimics对重组肠道病毒71型在vero细胞复制的影响示意图。

图4mir124调控可提高重组肠道病毒71型的安全性示意图；

其中a为受mir124调控的重组肠道病毒71型(ev71-mir124t)感染不造成乳鼠死亡示意图，b为重组肠道病毒71型(ev71-mir124t)在脑组织的复制水平显著降低示意图。图5重组肠道病毒71型抑制肿瘤细胞示意图。其中a为重组肠道病毒71型(ev71-mir124t)在肿瘤细胞中的一步生长曲线示意图，b为重组肠道病毒71型(ev71-mir124t)可有效引起肿瘤细胞裂解反应示意图。

图6为重组肠道病毒71型抑制小鼠皮下成瘤肿瘤组织生长示意图。

图7为重组肠道病毒71型治疗延长脑内荷瘤小鼠生存期示意图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。本发明实施例中所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例涉及到的肠道病毒71型毒株包括a、b、c三个基因型，其中a亚型brcr标准株(genbank获取号u22521)，c4亚型ah1(genbank获取号gq994988)、hn1(genbank获取号gu196833)、hn2(genbank获取号gq994992)、cq1(genbank获取号gq994989)和cq2(genbank获取号gq994990)株。

本发明是将在肿瘤中特异性低表达的人源mir124靶序列插入到肠道病毒71型brcr中获得的重组溶瘤肠道病毒71型为例进行说明；将其他的在肿瘤中特异性低表达的靶序列插入至已报道的其他肠道病毒71型毒株后获得的重组肠道病毒71型也能完成本发明。

实施例1：

肠道病毒71型溶瘤功能的发现：

1)肠道病毒71型对不同的肿瘤细胞均有溶瘤效果：肠道病毒71型brcr感染(moi＝20)单层的人神经母细胞瘤细胞系sk-n-sh(sk)、小胶质瘤细胞系t98g、神经胶质瘤细胞系ccf-sttg1(ccf)和横纹肌肉瘤细胞系rd，通过乳酸脱氢酶(ldh)细胞毒性检测试验，结果显示，ev71感染48h后，在sk、t98g、ccf和rd等肿瘤细胞的细胞毒性指数分别为79.4±1.6％、77.8±1.9％、73.9±1.1％和81.3±2.7％。病毒感染96h后，在上述四种肿瘤细胞的细胞毒性指数分别为84.2±0.8％、84.6±1.4％、82.9±2.1％和88.2±2.8％。ev71对不同肿瘤细胞都具有较好的溶瘤活性。

2)ev71具有杀伤肿瘤细胞的靶向性：肠道病毒71型brcr株感染(moi＝1)人神经胶质瘤细胞系ccf-sttg1和正常神经胶质细胞，ev71感染胶质瘤细胞可引起显著细胞病变反应，相较而言，ev71感染正常胶质细胞仅引起局部细胞变圆、皱缩等反应。ev71感染48h后，在胶质瘤细胞和正常胶质细胞的细胞毒性指数分别为60.2％和8.2％，两者差异极显著(p﹤0.001)；ev71感染96h后，在上述两种细胞的细胞毒性指数分别为76.2％和18.1％，两者差异极显著(p﹤0.001)。

3)不同基因型的肠道病毒71型对神经胶质瘤细胞均有溶瘤效果：肠道病毒71型brcr、ah1、hn1、hn2、cq1和cq2株感染(moi＝0.2，2或20)单层人神经胶质瘤细胞系ccf-sttg1、u87mg和u118mg，24h后通过ldh试验检测细胞裂解反应；发现不同基因型ev71均对肿瘤细胞具有杀伤作用，且溶瘤ev71的活性与感染剂量有关。

实施例2：

受mirna调控的重组肠道病毒71型的获得：

(1)pcr扩增包含目标序列的插入位点上游和下游片段，目标序列为3个拷贝人源mir124靶序列，1个拷贝的人源mir124靶序列为seqidno.1所示；以3个拷贝的小杆线虫cel-mir-39靶序列为阴性对照，1个拷贝的小杆线虫cel-mir-39靶序列为seqidno.2所示；

(2)利用同源重组方法连接插入位点上游和下游片段。重组片段和ev71-brcr-tr感染性克隆(jgenvirol.,2005,86:1391)载体均经avrii和mfei双酶切处理。通过t4dna连接酶介导的连接反应，将重组片段克隆至载体avrii和mfei酶切位点之间的相应区域。构建的重组病毒感染性克隆示意图如图1所示。重组病毒感染性克隆pev71-mir124t序列为seqidno.3所示，重组病毒感染性克隆pev71-celtcon序列参见seqidno.4所示。

(3)利用体外转录获得重组病毒感染性克隆的rna，瞬时转染至敏感细胞vero，拯救子代病毒，经空斑纯化，获得基因组中包含目标序列的重组溶瘤肠道病毒71型。基因组含有mir124靶序列的重组病毒命名为ev71-mir124t，基因组含有小杆线虫cel-mir-39靶序列的重组病毒命名为ev71-celtcon。

实施例3：

受mirna调控的重组肠道病毒71型的复制能力检测：

野生型ev71brcr以及重组型ev71-mir124t和ev71-celtcon以感染复数为1(moi＝1)感染不表达相应mirna细胞(本实施例中vero细胞不表达mir124)，通过一步生长曲线检测病毒扩增能力。结果如图2所示，如野生型病毒相比，重组病毒的扩增能力没有显著变化，表明插入mir靶序列对病毒扩增没有显著影响。

实施例4：

mirnamimics调控重组溶瘤肠道病毒71型复制的应用，步骤如下：

在vero细胞瞬时转染mir124mimics(10、50或200nm)，4h后重组病毒ev71-mir124t感染vero细胞(moi＝2)，感染24h收集细胞培养上清，利用tcid50法检测病毒滴度。如图3中a所示，未经处理组的病毒滴度为10^7.7tcid50/ml，转染10、50、200nm组的病毒滴度分别为10^7.1、10^5.7(与未经处理组相比p﹤0.001)、10^5.0(与未经处理组相比p﹤0.001)tcid50/ml。

在vero细胞瞬时转染200nmmir124mimics，4h后野生型ev71brcr、重组病毒ev71-mir124t或ev71-celtcon感染细胞(moi＝2)，感染24h后利用tcid50法检测病毒滴度，并通过ldh试验检测病毒感染引起的细胞裂解反应。如图3中b所示，较之野生型ev71brcr(10^7.7tcid50/ml)和重组对照病毒ev71-celtcon(10^7.5tcid50/ml)，外源mir124可显著降低ev71-mir124t(10^5.1tcid50/ml)感染vero细胞滴度(与野生型ev71brcr相比p﹤0.001)。如图3中c所示，较之野生型ev71brcr(79.9％)和重组对照病毒ev71-celtcon(80.4％)，外源mir124可显著降低ev71-mir124t(36.4％)感染vero引起的细胞裂解反应(与野生型ev71brcr相比p﹤0.001)。加入mirnamimic阴性对照或不加入mirnamimic对病毒感染没有显著影响。结果表明，外源mir124可特异性调控重组病毒ev71-mir124t感染。

实施例5：

mir124调控可提高重组肠道病毒71型的安全性的应用，步骤如下：

野生型ev71brcr或重组病毒ev71-mir124t脑内感染(10⁷tcid50s)1日龄balb/c乳鼠，对照组为脑内接种相同体积的细胞培养上清液。逐日观察小鼠死亡情况，收集小鼠脑组织上清液，通过tcid50法检测脑内病毒滴度。结果如图4中a所示，野生型ev71brcr可引起25％乳鼠死亡，重组病毒ev71-mir124t在观察期内未引起乳鼠死亡。结果如图4中b所示，感染2d后，野生型ev71brcr感染乳鼠的脑组织中病毒滴度为10^5.2tcid50/ml/g，重组病毒ev71-mir124t感染组的病毒滴度为10^0.5tcid50/ml/g，两者存在显著差异(p﹤0.001)。且在重组病毒ev71-mir124t感染组中，大多数受试个体未检测到病毒。

实施例6：

重组肠道病毒71型抑制肿瘤细胞的应用，步骤如下：

野生型ev71brcr或重组病毒ev71-mir124t感染人恶性胶质瘤细胞u87mg(moi＝1)，通过一步生长曲线检测病毒在肿瘤细胞的扩增情况。如图5中a所示，在恶性胶质瘤细胞中，重组病毒ev71-mir124t与野生型ev71brcr相比，病毒复制能力没有显著差异。

野生型ev71brcr或重组病毒ev71-mir124t感染人恶性胶质瘤细胞u87mg(moi＝2)，通过ldh实验检测病毒裂解肿瘤细胞反应。如图5中b所示，野生型ev71brcr和重组病毒ev71-mir124t感染引起的肿瘤细胞毒性指数分别为81.6％和82.4％，两者没有显著差异。结果表明，改造后的受mirna调控的重组ev71可有效抑制肿瘤细胞。

实施例7：

重组肠道病毒71型抑制小鼠皮下成瘤肿瘤组织生长，步骤如下：

将2×10⁶u87肿瘤细胞(100微升)注射至5-6周龄cd-1裸鼠(cd-1-foxn1nu/crl品系；购自北京维通利华)的右肋部皮下。当皮下肿瘤体积约为100mm³时，瘤体内注射一剂量(10⁷tcid50s)野生型ev71brcr或重组病毒ev71-mir124t，对照组为接种相同体积的细胞培养上清液。观察和记录肿瘤生长情况，使用电子游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积的计算公式为：(长径×短径²)×0.52。肿瘤任意方向的直径超过15mm时，视为动物试验仁慈终点。

结果如图6所示，治疗25d后，阴性对照组小鼠皮下肿瘤的体积平均为838mm³，野生型ev71brcr治疗组平均为98mm³(与阴性对照组相比p﹤0.001)，重组病毒ev71-mir124t治疗组平均为103mm³(与阴性对照组相比p﹤0.001)。ev71brcr和ev71-mir124t治疗组相比，两者无显著差异(p﹥0.05)。结果表明，受mirna调控的重组ev71治疗可抑制小鼠皮下成瘤肿瘤组织生长。

实施例8：

重组肠道病毒71型治疗延长脑内荷瘤小鼠生存期的应用，步骤如下：

将3×10⁵个u87肿瘤细胞(3微升)注射至5-6周龄cd-1裸鼠的右大脑纹状体区域。注射7天后，瘤体内注射一剂量(10⁵tcid50s)野生型ev71brcr或重组病毒ev71-mir124t，对照组为接种相同体积的细胞培养上清液。观察小鼠的饮食情况及精神状态，记录体重。当小鼠体重降低超过20％，或饮食、行动困难，或精神萎靡、共济失调，视为动物试验的仁慈终点。

如图7中a所示，野生型ev71brcr或重组病毒ev71-mir124t治疗可以延长荷瘤小鼠的生存期.。阴性对照组平均生存期为38.3d，ev71brcr治疗组平均生存期为61.4d(与阴性对照组相比p﹤0.001)，ev71-mir124t治疗组平均生存期为61.1d(与阴性对照组相比p﹤0.001)。ev71brcr和ev71-mir124t治疗组相比，两者无显著差异(p﹥0.05)。结果表明，受mirna调控的重组ev71治疗可延长脑内荷瘤小鼠生存期。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将属于本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>中国科学院武汉病毒研究所

<120>一种受microrna调控的重组溶瘤肠道病毒71型及应用

<160>4

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<212>dna

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