一种提高毕赤酵母分泌表达载体构建方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高毕赤酵母分泌表达载体构建方法。

背景技术：

随着生物技术的不断发展，利用基因工程技术开发重组蛋白已越来越受到人们的青睐。毕赤酵母(p.pastoris)作为甲醇酵母的一种，是单细胞低等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。毕赤酵母表达系统既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达系统以其独特的优势和潜力已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被国内外广泛应用于生产外源蛋白。

外源蛋白在毕赤酵母系统中的分泌机制是多样的，其中信号肽引导蛋白质的分泌是蛋白质释放的主要方式之一，信号肽(signalpeptide)是存在于分泌蛋白质n末端的特异氨基酸序列，引导新合成的分泌性蛋白质至不同的转运系统。迄今在毕赤酵母成功实现外源蛋白分泌表达的信号肽主要类型包括酿酒酵母α-交配因子(α-mf)信号肽、酿酒酵母转化酶信号肽(suc2)、毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽(pho1)以及一些蛋白自身信号肽等，不同信号肽对毕赤酵母表达分泌外源蛋白有不同影响，而α-mf信号肽在毕赤酵母表达中应用最为成功。α-mf信号肽源自于酿酒酵母α交配因子n端85氨基酸序列，包括n端19氨基酸信号肽(pre肽)和3个天冬氨酸连接糖基化的65肽(pro肽)。α-mf信号肽虽然应用最为广泛，但也存在着一些不足之处，部分蛋白以α-mf为信号肽引导表达时无法获得表达或高表达，因此，研究不同种类的信号肽对于实现外源基因的高效表达具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的问题是提供一种提高毕赤酵母分泌表达载体构建方法。

本发明所提供的提高毕赤酵母分泌表达载体是通过利用天然人i型胶原蛋白信号肽替换毕赤酵母表达载体ppic9k中酿酒酵母α-交配因子(α-mf)信号肽的pre肽序列来实现，具体方法如下：

1、ppic9k原始载体的点突变

ppic9k原始载体中含有两个xhoi酶切位点，分别在1192bp和5709bp位置，为了便于后期信号肽改造及外源基因的插入，将5709bp处xhoi酶切位点进行点突变。

2、提高毕赤酵母分泌表达载体的构建

(1)设计合成引物

根据天然人i型胶原蛋白信号肽的核苷酸序列和酿酒酵母α-交配因子信号肽序列，以天然人i型胶原蛋白信号肽替换酿酒酵母α-交配因子信号肽的pre肽为目的，设计合成引物，引物序列如下：

上游引物col1p-bf：5'-tatggatccaaacgatgttcagctttgtggacctccggctcctgctcctcttagcggccaccgccctcctgacgcacggcgctccagtcaacactacaac-3'

下游引物αmf-xr：5'-gcgctcgagagataccccttcttctttagcagcaatgc-3'

(2)信号肽的替换

以毕赤酵母ppic9k原始载体为模板，以上述引物进行pcr扩增，获得的基因片段与步骤1中xhoi酶切位点点突变的ppic9k载体进行bamhi和xhoi双酶切，酶切产物经纯化回收后，利用t4dna连接酶连接，转化大肠杆菌dh5α，获得信号肽改造后表达载体ppic9k-col1p。

上述步骤1中，优选将毕赤酵母ppic9k原始载体中5709bp处xhoi酶切位点序列中的第三位c突变为a，即将ctcgag突变为ctagag。

本发明的有益效果如下：

本发明利用天然人i型胶原蛋白信号肽替换毕赤酵母表达载体ppic9k中α-mf信号肽的pre肽，获得表达载体ppic9k-col1p，该表达载体实现了人溶菌酶的高分泌表达，但不局限于人溶菌酶一种蛋白。

附图说明

图1是实施例1中使用引物col1p-bf/αmf-xrpcr扩增产物dna凝胶电泳图。

图2是使用ppic9k-col1p改造载体和ppic9k原始载体表达人溶菌酶摇瓶上清sds-page电泳检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

1、ppic9k原始载体的点突变

毕赤酵母ppic9k原始载体中含有两个xhoi酶切位点，分别在1192bp和5709bp位置，为了便于后期信号肽改造及外源基因的插入，需将5709bp处xhoi酶切位点进行点突变。我们根据毕赤酵母ppic9k原始载体序列，选取其5435bp-6037bpdna序列，将其中5709bp处xhoi酶切位点序列中的第三位c调整为a，然后将该段序列进行全基因合成。合成后的基因片段与ppic9k原始载体(购于invitrogen公司)分别经xmai和sphi双酶切，然后将ppic9k酶切产物和合成基因酶切产物利用t4dna连接酶连接、转化筛选，并经测序鉴定，获得点突变成功的ppic9k。鉴定结果如下：

ppic9k原始序列：tatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgttt

ppic9k突变序列：tatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgttt

2、提高毕赤酵母分泌表达载体的构建

(1)设计合成引物

根据天然人i型胶原蛋白信号肽的核苷酸序列(atgttcagctttgtggacctccggctcctgctcctcttagcggccaccgccctcctgacgcacggc)，以及α-mf信号肽序列，以天然人i型胶原蛋白信号肽替换α-mf信号肽的pre肽为目的，设计合成引物，上游引物引入bamhi限制性酶切位点ggatcc，下游引物引入xhoi酶切位点ctcgag，引物序列如下：

上游引物col1p-bf：

5'-tatggatccaaacgatgttcagctttgtggacctccggctcctgctcctcttagcggccaccgccctcctgacgcacggcgctccagtcaacactacaac-3'

下游引物αmf-xr：

5'-gcgctcgagagataccccttcttctttagcagcaatgc-3'

(2)信号肽的替换

以毕赤酵母ppic9k原始载体为模板，以上述引物进行pcr扩增，扩增条件为：退火温度56℃，30个循环，获得的pcr产物的电泳检测图片见图1，从图中可以看出，获得的基因片段与理论大小275bp一致，然后回收纯化该pcr产物，连接pmd18-t载体送测序，测序显示结果正确，命名为t-col1p。

将测序正确的基因片段与上述步骤1中xhoi酶切位点点突变的ppic9k载体进行bamhi和xhoi双酶切，酶切产物经纯化回收后，利用t4dna连接酶连接，转化大肠杆菌dh5α，获得信号肽改造后表达载体ppic9k-col1p，经测序鉴定正确。

发明人利用实施例1获得的表达载体ppic9k-col1p进行人溶菌酶的表达，具体方法如下：

1、根据人溶菌酶(hlyz)的基因序列设计引物，在上游引物中添加xhoi酶切位点ctcgag，同时在xhoi酶切位点后添加aaaaga，可在表达过程中经kex2酶切割，获得天然n端目的蛋白；在下游引物中添加ecori限制性酶切位点gaattc，引物序列如下：

上游引物lyz-xu：5'-gcctcgagaaaagaaaggtctttgaaaggtgtga-3'

下游引物lyz-el：5'-cggaattcttacactccacaaccttgaa-3'

2、以人皮肤组织cdna为模板，以lyz-xu/lyz-el为引物进行pcr，连接t载体并经测序获得正确的hlyz基因，命名为t-hlyz，然后利用限制性内切酶对t-hlyz和实施例1的表达载体ppic9k-col1p同时进行xhoi和ecori双酶切，回收纯化酶切产物，t4连接酶连接，并转化大肠杆菌dh5α，获得表达载体ppic9k-col1p-hlyz。然后将获得的表达载体ppic9k-col1p-hlyz电转化毕赤酵母，g418筛选高拷贝菌株，经摇瓶鉴定表达结果，获得表达菌株gs115/ppic9k-col1p-hlyz，同时与ppic9k原始载体构建的毕赤酵母菌株gs115/ppic9k-hlyz(申请人采用常规方法构建并保存)摇瓶结果作sds-page电泳比较(插入拷贝数相同)。结果显示，利用本发明实施例1获得的表达载体表达hlyz，表达量明显提高，结果见图2，经上清液hlyz含量测定，ppic9k原始载体构建菌株gs115/ppic9k-hlyz摇瓶上清液表达量约为280mg/l，而利用本发明实施例1的表达载体构建的菌株gs115/ppic9k-col1p-hlyz摇瓶上清液表达量约为410mg/l，表达量提高约46％。