本发明属于药物化学领域，具体讲，涉及一种(r)-邻氯扁桃酸的制备方法。
背景技术：
(r)-邻氯扁桃酸为白色结晶性粉末，化学式为c8h7clo3，分子量为186.59，熔点为86～92℃，是一种重要的医药中间体和精细化工品，是用于合成新型安全有效的抗血小板聚集药物氯吡格雷的原料。氯吡格雷作为全球重磅级药物，是目前市场最畅销的药物。随着氯吡格雷专利到期，全球掀起了一股仿制热潮，因此作为其重要的中间体的(r)-邻氯扁桃酸在国内外的需求不断增长。因此如何高效廉价的制备大量高纯度的(r)-邻氯扁桃酸将具有重要的市场价值。
国内外通过腈水解酶法制备(r)-邻氯扁桃酸已有许多，如下式所示：
但无一不需要根据反应条件使用合适的反应缓冲液。因此，在工业级水平生产(r)-邻氯扁桃酸，将产生大量的废液排放，对环境造成一定的危害。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于提出一种(r)-邻氯扁桃酸的制备方法。
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种(r)-邻氯扁桃酸的制备方法，至少包括以下步骤：
(1)培养表达腈水解酶的大肠杆菌工程菌；
(2)采用培养获得的工程菌作为催化剂、邻氯扁桃腈作为底物、反应缓冲液作为反应介质进行反应；
(3)反应结束后，分离收集上清液；
(4)提取所述上清液中的(r)-邻氯扁桃酸后获得流穿液，所述流穿液在步骤(2)中作为所述反应缓冲液循环使用至少一次。
可选的，所述流穿液在步骤(2)中作为所述反应缓冲液循环使用5～20次，优选为8～15次。
可选的，当所述流穿液在步骤(2)中作为所述反应缓冲液循环使用造成反应体积减少时，补充新的反应缓冲液。
可选的，所述反应缓冲液的ph为7.0～9.0；
优选的，所述反应缓冲液选自kh2po4/k2hpo4缓冲液、nah2po4/na2hpo4缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液中的至少一种；
更优选地，所述步骤(2)反应体系的ph为7.5～8.5。
可选的，在步骤(2)中，所述转化反应的反应温度为25～50℃，优选为25～45℃，更优选为30℃。
可选的，在步骤(2)的反应体系中，所述工程菌细胞的浓度为10g/l～40g/l；
优选的，步骤(2)中的反应体系中还添加助溶剂；助溶剂优选碳原子数为1～8的醇、碳原子数为6～12的烷烃中的至少一种。
可选的，在步骤(2)中，所述底物通过5～7次分批流加，优选为6次；每次流加底物的浓度为10～50mm。
可选的，在步骤(3)中，所述分离的方法选自离心、抽滤、压滤中的至少一种；
优选的，所述离心采用6000～10000rpm，更优选为7000rpm。
可选的，在步骤(4)中，所述提取的方法为采用阴离子树脂进行吸附，优选为弱碱型阴离子树脂。
可选的，所述制备方法还包括以下步骤：
(5)使用洗脱液对步骤(4)中吸附后的阴离子树脂进行洗脱，得到洗脱液；所述洗脱液优选为1～2m的盐酸；
(6)采用有机溶剂萃取所述洗脱液水相中的(r)-邻氯扁桃酸，分离有机溶剂并纯化，得到所述r-邻氯扁桃酸的晶体；
所述有机溶剂优选乙酸乙酯或氯仿；所述分离的方法优选为旋转蒸发。
本发明的技术方案至少具有以下有益的效果：
本发明采用分离上清液中的产物，从而获得含极少量产物的流穿液，本发明通过将所得流穿液直接用于转化反应作为缓冲液，从而显著提高了反应缓冲液的利用率，从而降低了(r)-邻氯扁桃酸的生产成本，进而降低氯吡格雷的生产成本，将会产生良好的经济和社会效益。本发明的方法显著减少了废液的排放，实现(r)-邻氯扁桃酸的绿色环保生产，对实现(r)-邻氯扁桃酸工业化生产具有重要意义，还可以提高我国的生物、化工、医药等领域的手性药物的生产水平，有利于促进我国绿色生产、工业生物技术的发展，对我国经济的可持续发展具有重要意义。
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
具体实施方式
本发明实施例涉及一种(r)-邻氯扁桃酸的制备方法，通过培养获得的工程菌作为催化剂、邻氯扁桃腈作为底物、反应缓冲液作为反应介质进行反应；反应结束后，分离收集上清液；提取上清液中的(r)-邻氯扁桃酸后获得流穿液，流穿液中含有极少量的产物，本发明实施例通过循环使用反应缓冲液，反应循环次数可达10次以上，因此本发明实施例与等量的反应缓冲液相比，缓冲液利用率提高了10倍。
具体的，本发明实施例的制备方法至少包括以下步骤：
(1)培养表达腈水解酶的大肠杆菌工程菌；
(2)采用培养获得的工程菌作为催化剂、邻氯扁桃腈作为底物、反应缓冲液作为反应介质进行反应；
(3)反应结束后，分离收集上清液；
(4)提取所述上清液中的(r)-邻氯扁桃酸后获得流穿液，流穿液在步骤(2)中作为所述反应缓冲液循环使用至少一次。
具体的，在步骤(1)中所使用的表达腈水解酶的大肠杆菌工程菌，可采用市售菌株，并优选采用申请号201510978973.7公开的方法中构建的工程菌。
可选的，步骤(1)中的培养包括通过摇瓶培养或者发酵罐培养，离心收集工程菌细胞。
可选的，步骤(2)中的反应体系中还可添加助溶剂；具体的，助溶剂可选自碳原子数为1～8的醇、碳原子数为6～12的烷烃中的至少一种；具体可选自乙醇、甲醇、正己烷、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、正己醇、正戊醇、正辛醇等有机溶剂中的一种或者几种，助溶剂添加的量为反应体积总体积的1％～10％。
可选的，流穿液在步骤(2)中作为反应缓冲液循环使用5～20次，如果循环次数过高，则缓冲液中离子强度等参数变化显著，不利于反应正常进行；如果循环次数过少，反应缓冲液重复利用率低，单位体积缓冲液的产品产出比低，减少废水排放的优势不明显。
优选的，流穿液循环使用6～18次，更优选的，流穿液循环使用8～15次。
可选的，当流穿液作为反应缓冲液循环使用造成反应体积减少时，补充新的反应缓冲液。本发明实施例中的步骤(3)和(4)会造成反应体系体积的减少，添加新的反应缓冲液以弥补损失的体积，从而可进一步提高产物的收率。
可选的，在步骤(2)中，反应缓冲液的ph为7.0～9.0。
优选的，反应缓冲液可选自kh2po4/k2hpo4缓冲液、nah2po4/na2hpo4缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-hcl缓冲液中的至少一种，并不限于此。
优选的，步骤(2)中反应体系的ph为7.5～8.5。
优选的，在反应过程中可采用1～2mhcl和1～2mnaoh调节反应体系的ph值。
可选的，在步骤(2)中，转化反应的反应温度为25～50℃，转化反应的反应温度的上限可为50℃、48℃、45℃、42℃、40℃、38℃，转化反应的反应温度的下限可为25℃、28℃、30℃、35℃，温度范围可由上限、下限中的任意数值组成。转化反应的反应温度优选为25～45℃，更优选为30℃。
可选的，在步骤(2)的反应体系中，工程菌细胞的浓度为10g/l～40g/l。工程菌细胞的浓度的上限可为40g/l、35g/l、30g/l、25g/l、22g/l，工程菌细胞的浓度的下限可为10g/l、12g/l、15g/l、18g/l、20g/l；工程菌细胞的浓度的范围可由上限、下限中的任意数值组成。
可选的，在步骤(2)中，底物通过5～7次分批流加，优选为6次。如果底物补加次数过多，则反应后程速率明显降低，而且会积累大量醛、底物等杂质，降低反应收率；如果底物补加次数过低，则体系积累的产物浓度低，体系内酶催化剂的催化潜力没有得到充分发挥，造成经济上的浪费。
每次流加底物浓度为10～50mm。如果底物浓度过高则会引起酶催化剂的不可逆失活；如果底物浓度过低则产物ee值会偏低，而且体系产物浓度积累速率过慢，造成后处理成本的浪费。
每次流加底物浓度的上限可为50mm、48mm、45mm、40mm、35mm、30mm，每次流加底物浓度的下限可为10mm、12mm、15mm、20mm、22mm、25mm。每次流加底物浓度的范围可由上限、下限中的任意数值组成。优选的，每次流加底物浓度为20～45mm，更优选为25～30mm。
当本发明实施例中每次流加底物浓度为25mm，当每次常规反应流加6次底物时，则底物催化浓度可达到1500mm，从而可显著提高缓冲液的产物产出比。
可选的，在步骤(2)中，催化剂、底物、反应缓冲液以及助溶剂通过磁力搅拌混合均匀。
可选的，在步骤(3)中，分离的方法选自离心、抽滤、压滤中的至少一种；并优选离心。
可选的，离心采用6000～10000rpm，优选为6000～8000rpm，更优选为7000rpm。
可选的，在步骤(4)中，提取的方法为采用阴离子树脂进行吸附，优选为弱碱型阴离子树脂。具体可选择弱碱330阴离子树脂(上海树脂厂)、弱碱#301阴离子树脂(南开大学树脂厂)，或amerliteir-4b、dowex3、permutitw、wofatitm。本发明实施例中的树脂使用前参照所购买树脂产商的使用说明书进行相应的活化处理。
可选的，本发明实施例的制备方法还包括以下步骤：
(5)使用洗脱液对步骤(4)中吸附后的阴离子树脂进行洗脱，得到洗脱液；
优选的，洗脱液为1～2m的盐酸；
(6)采用有机溶剂萃取洗脱液水相中的(r)-邻氯扁桃酸，分离有机溶剂并纯化，得到r-邻氯扁桃酸的晶体；
优选的，有机溶剂选自乙酸乙酯或氯仿；
优选的，分离的方法为旋转蒸发。
下面结合具体实施例进一步详述本发明。如无特别说明，本发明的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。
实施例1
1、在250ml的三角瓶中加入100ml磷酸缓冲液(nah2po4/na2hpo4缓冲液)，ph在7.5～8.5，加入1.5g的工程菌细胞、30mm底物邻氯扁桃腈以及助溶剂(甲醇，添加量为反应体系体积的1％)，在220rpm的摇床中反应，其中底物通过6次分批流加，每次流加底物浓度为25mm，用薄层层析监测反应的终点。当底物反应完后，离心去除不溶物，将上清液转移到经活化的弱碱型阴离子树脂，吸附上清液中的产物(r)-邻氯扁桃酸，收集流穿液，记为反应液1；再使用50ml2mhcl洗脱树脂上的产物，收集洗脱液，记为洗脱液1。
2、转移反应液1至在250ml的三角瓶中，加入1.5g的工程菌细胞、30mm底物邻氯扁桃腈以及助溶剂(甲醇，添加量为反应体系体积的1％)，在220rpm的摇床中反应，其中底物通过6次分批流加，每次流加底物浓度为25mm，用薄层层析监测反应的终点。当底物反应完后，离心去除不溶物，将上清液转移到经活化的弱碱型阴离子树脂，吸附上清液中的产物(r)-邻氯扁桃酸，收集流穿液，记为反应液2；再使用50ml2mhcl洗脱树脂上的产物，收集洗脱液，记为洗脱液2。
如此循环进行10次，分别收集洗脱液1～11。洗脱液进行hplc分析，检测结果如下表1。
表1反应液不同循环次数所制备产物(r)-邻氯扁桃酸的检测结果
注1：底物为邻氯扁桃腈消旋体。
注2：反应液体积减少后未补加新的反应缓冲液。
注3：循环10次，催化得底物浓度相当于1500mm。
实施例2
实施例2只在每次测量收集的反应液体积后，补充损失的体积，其他实施同实施例1，所得洗脱液产物结果如表2：
表2：
注1：底物为邻氯扁桃腈消旋体。
注2：反应液体积减少后补加新的反应缓冲液。
注3：循环10次，催化得底物浓度相当于1500mm。
由本实施例的实验结果可知，通过补加新的反应缓冲液可进一步显著提高产物的收率。
实施例3
实施例3只在每次测量收集的反应液体积后，补充损失的体积，持续进行20次，其他实施方式同实施例1，所得洗脱液产物结果表3。
表3：
注1：底物为邻氯扁桃腈消旋体。
注2：反应液体积减少后补加新的反应缓冲液。
注3：循环15次，催化得底物浓度相当于2250mm。
由本实施例的实验结果可知，通过补加新的反应缓冲液可显著提高产物的收率。随着循环次数的增加，产物的收率出现下降的趋势，因此本发明循环的次数优选为8～15次。
实施例4：
和实施例1相比，实施例4在步骤1和步骤2中，底物通过5批分批流加，其他实施方式同实施例1；所得洗脱液产物结果表4。
表4
注1：底物为邻氯扁桃腈消旋体。
注2：反应液体积减少后未补加新的反应缓冲液。
由实施例4的实验结果可知：每个循环流加5批底物，虽然反应各种质量指标没有明显变化，但同等条件下，缓冲液循环6次，实施例4中底物催化浓度为750mm，低于实施例1的900mm。缓冲液的产物容量没有得到充分利用，从产能及经济角度考虑，实施例4选取的底物补加次数对应的产出低于比不如实施例1的底物补加次数对应的产出比。
对比例
对比例1：和实施例1相比，对比例1在步骤1和步骤2中，每次流加底物浓度为8mm，其他实施方式同实施例1；
对比例2：和实施例1相比，对比例2在步骤1和步骤2中，每次流加底物浓度为55mm，其他实施方式同实施例1；
对比例3：和实施例1相比，对比例3在步骤1和步骤2中，底物通过8批分批流加，其他实施方式同实施例1。
所得洗脱液产物结果表5。
表5
由对比例1的实验结果可知：当补加底物浓度过低时，出现如下缺点：(1)过低的底物浓度，此时酶催化活性大大过剩，这时候由于酶的r型光学选择性不是绝对的，会错误结合少量s型底物并催化生成s型产物(虽然反应能障高，但会发生)。这样会导致反应后的ee值较实施例1相比偏低3％左右(由于纯化产品的ee值始终偏低，则缓冲液循环使用6次后即停止进行实验)。(2)同等条件下，缓冲液循环6次，对比例1底物催化浓度为288mm，远低于实施例1的900mm。从产能及经济角度考虑，对比例1选取的底物补加浓度对应的催化效果不如实施例底物补加浓度对应的催化效果好。
由对比例2的实验结果可知：当补加底物浓度过高时，此浓度下的底物浓度会让酶催化剂(蛋白质)发生不可逆失活，在补加第三次底物后，反应不能继续进行，体系产物纯度低，在此基础上纯化收率比正常收率偏低10％左右。(第一轮循环未完成，实验终止)。
由对比例3的实验结果可知：
底物通过8批分批流加，每个循环底物累积浓度超出了酶催化剂的最佳催化效能，会导致体系反应后程速率明显降低，而且会积累大量醛、底物等杂质，降低反应收率。此外，此条件下体系中较多的杂质会影响树脂纯化效率，增大树脂再生成本。说明对比例3选择的8批补加次数不适合实际生产。
通过对比例与本发明实施例的效果对比，说明本发明相应参数选择对应的技术效果是目前的最优组合，进一步体现出了本发明的技术优势。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。