双功能抗体及其用途的制作方法

本发明涉及抗体，具体涉及能够同时阻断人tnf-α与tnf-α受体的结合和阻断人il-12与il-12受体的结合的双功能抗体。
背景技术：
：humira(adalimumab)是在中国仓鼠卵巢细胞中表达的重组全人源化肿瘤坏死因子α单克隆抗体。除了中度至重度类风湿性关节炎，fda已批准的适应症还包括中度至重度慢性斑块型银屑病，中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎、克罗恩病儿科患者的治疗用途。2013年，在全球十大畅销品牌药物中，阿达木单抗销售额为106.6亿美元、增长率为15.0％，排名第一。单抗药物stelara(ustekinumab)作用于il-12和il-23的共同亚基p40，通过阻断il-12和il-23的下游信号通路从而起到抗银屑病的作用。stelara于2009年被美国fda批准，用于治疗成年人中重度银屑病。一项针对中度至重度银屑病患者iii期临床研究显示，p40单抗更具治疗优势，且所需注射次数远少于依那西普。据皮肤性病欧洲科学院第17次会议报道：分别接受p40单抗(低剂量45mg和高剂量90mg两组)和依那西普进行为期12周的治疗，p40单抗组在治疗开始和第4周共给药2次，依那西普组每周给药2次。结果显示，银屑病严重程度缓解率达到75％者，p40单抗45mg和90mg剂量组分别为68％和74％，而依那西普组为57％。单克隆抗体的作用靶点是针对单一某个靶点，而大量的复杂性疾病，如肿瘤、类风湿关节炎、肿瘤、自身免疫病、代谢性疾病的器官并发症、老年退行性病变等有多种发病机制，且各种发病机制可相互影响，有时呈网络状，共同导致了疾病的发生。针对某一疾病单一靶点的单克隆抗体药效有限。双功能抗体对此疾病发病过程中最重要的发病机理(信号通路)同时干预，有望获得药效的相加或协同，取得更好地临床疗效。针对tnf-α和p40同时干预和阻断，有望在银屑病治疗方面相对于单一靶点干涉取得更好地疗效。因此目前需要开发同时拮抗tnf-α和抗p40的双功能抗体。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了三种双功能抗体，所述三种抗体既能阻断人tnf-α与tnf-α受体的结合，还能阻断人il-12与il-12受体的结合，本发明还提供所述三种双功能抗体的用途。为实现上述目的，所采取的技术方案：一种双功能抗体，所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链，所述轻链的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述重链的氨基酸序列如seqidno.2所示。将这里所述的双功能抗体命名为双功能抗体biau003。一种双功能抗体，所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链，所述轻链的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述重链的氨基酸序列如seqidno.3所示。将这里所述的双功能抗体命名为双功能抗体biau022。一种双功能抗体，所述双功能抗体包括2条相同的轻链和2条相同的重链，所述轻链的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述重链的氨基酸序列如seqidno.5所示。将这里所述的双功能抗体命名为双功能抗体biau023。本发明提供了上述所述的三种双功能抗体在制备用于阻断人tnf-α与tnf-α受体的结合和/或阻断人il-12与il-12受体的结合的制剂中的用途。本发明还提供了上述所述的三种双功能抗体在制备治疗类风湿性关节炎、慢性斑块型银屑病、中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎或克罗恩病儿科患者的药物中的用途。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种三种双功能抗体，本发明的3种双功能抗体能够与人tnf-α特异性结合；同时3种双功能抗体能够与人p40特异性结合。所述三种双功能抗体均能够十分有效地阻断人il-12与il-12受体的结合，并且均能够十分有效地阻断人tnf-α与tnf-α受体的结合。本发明的3种双功能抗体能够同时结合人tnf-α和人p40蛋白，能有效地抑制tnf-α和il-12与相应受体的结合，从而分别抑制炎症细胞因子和ifngamma分子的分泌，能够用于治疗类风湿性关节炎、慢性斑块型银屑病、中度至重度克罗恩病、中度至重度溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、中度至重度多关节型幼年特发性关节炎、克罗恩病儿科患者。附图说明图1为本发明所述双功能抗体biau003的结构示意图；图2为本发明所述双功能抗体biau022的结构示意图；图3为本发明所述双功能抗体biau023的结构示意图；图4为本发明实施例4中elisa方法检测本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023对p40的结合能力(a)，和对tnf-α结合能力(b)的结果；图5为本发明实施例5中本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023抑制tnf-α诱导的细胞表面粘附分子elam-1表达的结果；图6为本发明实施例6中本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023抑制il-12诱导的ifngamma分泌的结果；图7为本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023对银屑病小鼠皮肤增厚的抑制结果。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本发明所述双功能抗体biau003的轻链的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述双功能抗体biau003的重链的氨基酸序列如seqidno.2所示；本发明所述双功能抗体biau022的轻链的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述双功能抗体biau003的重链的氨基酸序列如seqidno.3所示；本发明所述双功能抗体biau003的轻链的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述双功能抗体biau003的重链的氨基酸序列如seqidno.5所示。本发明所述双功能抗体biau003的结构示意图如图1所示，其中重链由以下部分构成：第一抗体的重链可变区-第一抗体重链恒定区-ggggs氨基酸linker-第二抗体重链可变区--ggggs氨基酸linker-第二抗体轻链可变区；即第一抗体的完整重链与第二抗体重链可变区-第二抗体轻链可变区通过氨基酸连接起来。轻链由以下部分构成：第一抗体的完整轻链。本发明所述双功能抗体biau022的结构示意图如图2所示，其中重链由以下部分构成：第二抗体的重链可变区-ggggs氨基酸linker-第一抗体重链可变区-第一抗体重链恒定区；即第二抗体的重链可变区与第一抗体完整重链通过氨基酸连接起来。轻链由以下部分构成：第二抗体的轻链可变区-ggggs氨基酸linker-第一抗体轻链可变区-第一抗体轻链恒定区；即第二抗体的轻链可变区与第一抗体完整轻链通过氨基酸连接起来。本发明所述双功能抗体biau023的结构示意图如图3所示，其中重链由以下部分构成：第一抗体的完整重链-ggggs氨基酸linker-第二抗体重链可变区-第二抗体轻链恒定区-ggggs氨基酸linker-第二抗体轻链可变区-第二抗体重链恒定区1；轻链由以下部分构成：第一抗体完整轻链。实施例1：本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023的蛋白制备根据双功能抗体biau003、biau022和biau023的重链和轻链氨基酸序列，分别人工合成双功能抗体biau003、biau022和biau023的重链和轻链的cdna。所有cdna均经过密码子优化，可用于哺乳动物细胞表达。将合成的cdna分别克隆到pcdna3.1质粒中，并通过测序确定质粒构建正确。测序完的质粒转化top10菌株，挑取单菌落，接种到0.5升lb液体培养基，至od600为0.8时，离心收集菌体，用质粒大提试剂盒(购自qiagen公司)提取质粒。将测序鉴定正确的含有双功能抗体biau003的轻链的质粒和测序鉴定正确的含有双功能抗体biau003的重链的质粒共转染到同一个293f细胞中，将测序鉴定正确的含有双功能抗体biau022的轻链的质粒和测序鉴定正确的含有双功能抗体biau022的重链的质粒共转染到另一个293f细胞中，将测序鉴定正确的含有双功能抗体biau023的轻链的质粒和测序鉴定正确的含有双功能抗体biau023的重链的质粒共转染到另一个293f细胞中。转染细胞培养条件为37度，5％co2，130rpm/min。培养7天后，离心收集上清。将上清6000rpm离心10min，并用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；滤液加入500mmnacl；调整ph至7.4。样品经0.2μm滤膜再次过滤后，上样至已用pbs平衡好的hitrapmabselect柱(购自ge公司)；待样品上完后用pbs冲洗，流速5ml/min，紫外监测为水平。接着用洗脱buffer(0.5mglycine，ph3.0)洗脱，流速1ml/min，收集流出峰用tris中和至ph7.4。用超滤浓缩管浓缩洗脱峰，用脱盐柱换缓冲溶液至pbs中，由此得到biau003、biau022、biau023共3种双功能抗体。实施例2：spr测定本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023的结合抗原能力通过spr分析(购自ge公司)对p40和tnf-α亲和力及结合动力学。利用标准胺偶联化学和由ge公司提供的芯片，经伯胺将p40或tnf-α共价连接至芯片(羧甲基右旋糖酐包被的芯片)。利用生物素标记试剂盒(pierce公司)将重组融合蛋白与生物素共价偶联，然后流过亲和素标记的sa芯片(购自ge公司)，使反应值ru达到450。通过将抗体以0.01、0.03、0.09、0.27μm的浓度和50μl/min的流速在pbs缓冲液中流动而测量结合和解离常数。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用biaevaluation软件将结合和解离曲线拟合至1∶1朗格缪尔(langmuir)结合模型，测定结果表明：biau003、biau022、biau023均能够结合p40和tnf-α。测定的kd、kon和koff值结果见表一和表二。表一spr测定本发明双功能抗体结合抗原p40能力结果抗体名称kon(105m-1s-1)koff(10-5s-1)kd(nm)biau0031.872.020.11biau0221.742.190.13biau0230.872.960.34表二spr测定本发明双功能抗体结合抗原tnf-α能力结果实施例3：竞争elisa方法测定本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023与tnf-α受体竞争结合抗原tnf-α用tnf-α-mfc包被酶标板，1％bsa封闭，分别将不同浓度的抗体biau003、biau022、biau023与tnf-α受体-hfc混合，37℃孵育后加入酶标二抗37℃孵育30分钟。在酶标仪上检测450nm的吸光值。双功能抗体与抗原tnf-α结合结果显示，本发明双功能抗体biau003、biau022、biau023均能有效地与tnf-α受体竞争结合tnf-α蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系。通过对结合的双功能抗体的竞争elisa结果分析，曲线模拟双功能抗体biau003、biau022、biau023的拮抗tnf-α受体与抗原tnf-α结合效率ic50分别为：0.5nm、2.3nm、1.8nm。实施例4：本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023结合抗原能力检测本发明4价双功能抗体biau003、biau022和biau023能靶向同时结合p40和tnf-α蛋白。实验采用elisa方法检测双功能抗体对这个两个抗原的结合能力。首先分别包被2ug/ml的抗原，4度包被过夜，用pbst洗涤3次去除未结合的抗原后，直接加入不同浓度的双功能抗体，室温孵育2小时。孵育完毕后，pbst洗涤3次，以清洗去没有结合抗原的抗体。然后加入抗histag标签的二抗(hrp标记)孵育1小时。pbst清洗3次后，用dab法显色，然后用多功能酶标仪进行读数。如图4数据显示，本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023与阳性抗体都具有对各自抗原很强的结合能力(图4a为结合p40，图4b为结合tnf-α)。实施例5：本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023抑制elam-1蛋白表达细胞表面粘附分子elam-1表达受tnf-α调控，粘附分子的调控是tnf-α生物学效应的重要体现。本实验研究阻断tnf-α通路后，细胞表达elam-1蛋白的情况。接种2×105/孔huvec细胞于6孔板中，细胞贴壁后，分别加入10ng/ml和不同浓度的本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023，然后置于细胞培养箱中继续培养24h。24h后，胰酶消化细胞并用pbs洗涤后置于冰上，然后加入fitc标记的抗elam-1抗体，孵育30min。然后用流式细胞仪进行细胞表面荧光强度分析，对流式细胞仪的荧光强度数据用prism软件进行换算并作图。如图5结果显示本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023都可以完全阻断tnf-α诱导的elam-1蛋白表达，阻断的程度与双功能抗体浓度有剂量依赖关系(图5)实施例6：本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023抑制ifngamma的分泌本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023能靶向结合细胞因子il-12的p40亚基，从而抑制il-20的生物学功能。本实验检测本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023能否抑制il-12调控的ifngamma表达。纯化的t细胞在含细胞因子il-2的培养基中培养3天进行活化和增殖，第4天时，按1×105/孔的密度接种t细胞于96孔板中，按设置的浓度加入本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023。然后置于37度二氧化碳培养箱培养24小时。24小时后收集细胞培养基，离心取上清。取10ul上清进行ifngamma定量分析，按照定量试剂盒的说明方法进行实验，实验结果用多功能酶标仪进行读数。如图6结果表明t细胞在il-2和il-12作用下显著分泌ifngamma，随着本发明双功能抗体浓度的增加，其对ifngamma的分泌抑制越明显，而单独的il-2刺激并不能诱导t细胞分泌ifngamma(图6)实施例7：本发明双功能抗体biau003、biau022和biau023对银屑病小鼠的药效采用dba-1小鼠，背部皮下注射重组人il-12(30ug)联合重组人tnf-α(10ug)诱导小鼠产生银屑病病变。首次皮下注射人il-12和tnf-α前1天给予biau003，biau022，biau02320mg/kg，连续注射3天，第4天取背部皮肤固定，he染色后观察银屑病小鼠表皮厚度。小鼠表皮厚度如图7所示。由图可见，biau003，biau022，biau023均能有效地降低小鼠表皮厚度，药效优于单独ustekinumab和adalimumab组。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>叶才果<120>双功能抗体及其用途<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>214<212>prt<213>人工序列()<400>1aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyilesersertrp202530leualatrptyrglnglnlysproglulysalaprolysserleuile354045tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrasniletyrprotyr859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelysargthrvalalaala100105110proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly115120125thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala130135140lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln145150155160gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser165170175serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr180185190alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser195200205pheasnargglyglucys210<210>2<211>718<212>prt<213>人工序列()<400>2gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleulysilesercyslysglyserglytyrserphethrthrtyr202530trpleuglytrpvalargglnmetproglylysglyleuasptrpile354045glyilemetserprovalaspseraspileargtyrserproserphe505560glnglyglnvalthrmetservalasplysserilethrthralatyr65707580leuglntrpasnserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaargargargproglyglnglytyrpheaspphetrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserserserserthrlysglyproservalphe115120125proleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleu130135140glycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrp145150155160asnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleu165170175glnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproser180185190serserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislyspro195200205serasnthrlysvalasplysargvalgluprolyssercysasplys210215220thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro225230235240servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser245250255argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp260265270progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn275280285alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval290295300valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu305310315320tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulys325330335thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr340345350leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthr355360365cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu370375380serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu385390395400aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys405410415serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu420425430alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly435440445lysglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser450455460glyglyglyglysergluvalglnleuvalgluserglyglyglyleu465470475480valglnproglyargserleuargleusercysalaalaserglyphe485490495thrpheaspasptyralamethistrpvalargglnalaproglylys500505510cysleuglutrpvalseralailethrtrpasnserglyhisileasp515520525tyralaaspservalgluglyargphethrileserargaspasnala530535540lysasnserleutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthr545550555560alavaltyrtyrcysalalysvalsertyrleuserthralaserser565570575leuasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserserglygly580585590serglyglyserglyglyserglyglyserglyglyserglyglyser595600605glyglyaspileglnmetthrglnserproserserleuseralaser610615620valglyaspargvalthrilethrcysargalaserglnglyilearg625630635640asntyrleualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleu645650655leuiletyralaalaserthrleuglnserglyvalproserargphe660665670serglyserglyserglythraspphethrleuthrileserserleu675680685glnprogluaspvalalathrtyrtyrcysglnargtyrasnargala690695700protyrthrpheglyglncysthrlysvalgluilelysarg705710715<210>3<211>581<212>prt<213>人工序列()<400>3gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr202530alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralailethrtrpasnserglyhisileasptyralaaspserval505560gluglyargphethrilesera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