酮还原酶及其在不对称合成R-3,5-双（三氟甲基）苯乙醇中的应用的制作方法

本发明属于生物化工技术领域，特别是涉及一种酮还原酶及其在不对称合成r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中的应用。

背景技术：

r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇是合成阿瑞匹坦的关键中间体。阿瑞匹坦是由美国默克公司研发的一种神经激肽-1(nk-1)受体抑制剂，该药2003年经食品药品监督管理局(fda)批准上市，于2014年获准在中国上市，主要用于预防和治疗化疗后引起的急性和延迟性恶习呕吐等症状。

r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇可通过化学或者拆分获得，但是化学法或者拆分法局限在于收率比较低，拆分法理论上最高收率50％。

在生物学上，手性羟基化合物可通过酶催化合成，其反应条件温和，能够使产物对应选择性达到99％。目前，越来越多的药物或者中间体是通过生物催化的方式来合成的。生物催化法是通过对前体3,5-双(三氟甲基)苯乙酮不对称还原成r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，其合成方法如下所示：

专利cn102382780提供了一种氧化微杆菌及其制备手性双三氟甲基苯乙醇的方法，专利cn104212841提供了一种含离子液体共溶剂介质中制备(r)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，这两个专利中都运用了羰基还原酶来合成(r)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，但是底物浓度都比较低。专利cn106399398提供了一种(r)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的生物制备方法，运用qnr的酮还原酶来制备(r)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，但是该酶利用了有机试剂异丙醇来进行辅酶循环，有机试剂对酶活力有较大程度的损害，且有明显的抑制作用，在放大生产时更为明显。

技术实现要素：

针对已报道的不对称还原反应制备(r)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇反应中收率低、反应条件不友善以及成本比较高的问题，本发明的目的在于提供一种催化活性高、对映选择性强、收率比较高的酮还原酶，还提供了编码该酮还原酶的核酸，含有该核酸序列的重组表达质粒、包含所述重组表达质粒的重组表达菌株及其制备方法，以及该酮还原酶在不对称合成r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种酮还原酶，是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由seqidno:2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)在(a)所述多肽的基础上经过突变、缺失或添加一个或几个氨基酸的具有酮还原酶性质的多肽；所述突变是在所述多肽的基础上进行1-10个氨基酸的突变，即经过突变后的多肽仍然具有酮还原酶的性质，几个是指在1-30个的氨基酸，比如增加histag标签或添加一段分泌表达的信号肽；

(c)与(a)所述多肽具有至少90％同一性且具有酮还原酶活性的多肽。

一种编码本发明所述酮还原酶的核酸，所述核酸由seqidno:1所示的dna序列组成。

一种包含本发明所述核酸的重组表达质粒pet21a-mt-kred01。

一种包含本发明所述重组表达质粒的重组表达菌株。

本发明所述重组表达菌株的制备方法，包括以下步骤：

(a)将重组表达质粒转化到宿主细胞，涂布在含有50μg/ml氨苄的lb平板上，37℃过夜培养后，从中挑选阳性菌落接种到50ml液体lb培养基中进行培养；培养4h后，吸取10ml种子液转入1l新鲜的lb液体培养基；

(b)当培养的浓度达到od6000.6-1.0时，加入终浓度为0.1～0.2mmol/l的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，诱导温度为16-30℃，诱导培养为10-16h，诱导培养后通过离心或浓缩得到更高浓度的湿菌体，通常经过超声波破碎或者高压均质机破碎后离心收集上清液，即为重组表达菌株的粗酶裂解液。

本发明所述重组表达菌株的制备方法，其中，步骤(a)中所述宿主细胞为大肠杆菌e.colibl21(de3)。

本发明所述重组表达菌株的制备方法，其中，步骤(b)中加入终浓度为0.15mmol/l的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，诱导温度为28℃，诱导培养为12h。

本发明所述酮还原酶在不对称还原制备r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中的应用，在ph6.0～8.0的缓冲液中，在葡萄糖、葡萄糖脱氢酶(gdh)和辅酶存在下，所述酮还原酶对前体羰基化合物进行不对称还原反应，形成r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，所述前体羰基化合物为3,5-双(三氟甲基)苯乙酮，所述辅酶为nadp辅酶。

本发明所述酮还原酶在不对称还原制备r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中的应用，其中，包括以下步骤：

(1)在烧瓶中加入500ml50mm的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液ph为6.0-8.0，搅拌；

(2)再加入酮还原酶的粗酶裂解液，葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，再加入nadp辅酶以及前体羰基化合物，在28-32℃温度下反应，用2mol/l的碳酸钠控制ph，反应16h后用tlc点板检测反应完全；

(3)将反应体系升温至70-80℃加热1-2h，加入硅藻土过滤除蛋白，用等体积乙酸乙酯萃取水相和洗涤滤饼；

(4)萃取两次后合并有机相，用无水硫酸钠干燥后减压旋烝得油状物粗品，即得r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇。

本发明所述酮还原酶在不对称还原制备r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中的应用，其中，所述nadp辅酶为nadp⁺辅酶，所述nadp辅酶的用量为0.05～0.1g/l；所述3,5-双(三氟甲基)苯乙酮在反应液中的浓度为100-200g/l；所述酮还原酶的用量为500-1000u/l；所述葡萄糖的用量为120-300g/l，所述葡萄糖脱氢酶的用量200-2000u/l，所述葡萄糖的浓度为所述前体羰基化合物的1.2-1.5当量，上述各用量，太少，反应不好，用量太多，增加成本。

本发明有益效果：

本发明所述酮还原酶，可将底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮转化为r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，其氨基酸序列在合成r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中尚属于首次报道。

本发明所述酮还原酶在不对称还原制备r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中的应用，前体羰基化合物可高达200g/l，反应时间小于24h；nadp⁺作为辅酶，在液体酶反应时添加，且在全细胞时不需要添加昂贵的辅酶nadp⁺；产物r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇得率为96.8％，其e.e.值>99％，应用葡萄糖脱氢酶实现了nadp⁺/nadph之间的循环，避免了使用异丙醇等有机试剂对环境及酮还原酶的伤害。相对于现有的其它制备方法，使用本发明的述酮还原酶所制备的r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇不仅浓度和光学纯度高，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1为实施例2中pcr扩增电泳图，m为dna分子量标准，泳道1为pcr扩增的的酮还原酶基因；

图2为实施例3中sds-page电泳图，m为分子量标准，泳道1为酮还原酶的蛋白上清液。

下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1

酮还原酶mt-kred01基因的获得

(1)从安徽省合肥市中国科学技术大学采集土壤样本并提取dna(基因提取方法参考chromaspinte-1000，clontechlaboratories，inc.，usa)，将提取的dna样品用sau3ai酶切后，电泳后切胶回收0.5～4kb的dna片段，通过bamhi位点连接到puc19质粒上，从而得到基因组的质粒文库；

(2)将步骤(1)中所述质粒文库转化到大肠杆菌e.colitop10(购自北京全式金生物技术有限公司)，并涂布到有相应氨苄抗生素的lb平板上，挑选阳性克隆接种到加有500μllb(含相应氨苄抗生素)的96深孔孔板，37℃培养4h后加入终浓度为0.2mmol/l异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导，28℃继续培养诱导过夜；离心收集深孔培养物并加入50ul的10mmol/lph7.5的磷酸钠缓冲液，-80℃反复冻融三次后使细菌裂解；

(3)加入1mmol/l前体羰基化合物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮为底物、20mmol/l葡萄糖、1u葡萄糖脱氢酶(gdh)、0.001％的酚红，30℃培养4h，挑取颜色变红比较明显的孔所对应的深孔培养物，抽提质粒并送测序；用美国国家生物技术信息中心(ncbi)的orffinder分析序列的开放读码框(orf)，通过大量的数据挖掘及数据比对后筛选出orf核酸序列seqidno:1，并进一步得到其编码的氨基酸序列seqidno:2，获得seq.id.n02所示的酮还原酶蛋白序列。

实施例2

酮还原酶mt-kred01基因的克隆

根据seqidno:1合成引物对f1(核苷酸序列为seqidno:3)和f2(核苷酸序列为seqidno:4)；pcr20ul体系如下：2mmol/ldntp2μl，10×pcrbuffer2μl，pcr高保真酶0.5μl，实施例1获得的dna模板1μl，ddh2o12μl，f1和f2各1μl(5mmol/l)。pcr扩增步骤为：①95℃，预变性5min；②98℃，变性15s；③56℃退火30s；④72℃延伸45s；步骤②～④重复30次；⑤72℃继续延伸10min，冷却至16℃。pcr产物经琼脂糖电泳纯化，pcr扩增电泳结果如图1所示，在1000bp左右出现目标条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收所述目标条带，获得一条完整的序列，经dna测序，全长840bp，即获得seq.id.n01所示的酮还原酶基因的pcr产物。

实施例3

酮还原酶mt-kred01基因的表达

将实施例2中所述pcr产物和pet21a载体同时用ndei/xhoi双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目标片段；在t4dna连接酶的作用下，将所述目标片段与双酶切后的pet21a载体连接得到重组表达质粒pet21a-mt-kred01。

将上述重组表达质粒pet21a-mt-kred01转化到e.colibl21(de3)(购自北京全式金生物技术有限公司)感受态细胞，涂布在含有50μg/ml氨苄的lb平板上，37℃过夜培养后，从中挑选阳性菌落接种到50ml液体lb培养基中进行培养，液体lb培养基成分为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph7.2；培养4h后，吸取10ml种子液转入1l新鲜的lb液体培养基，培养到od600达0.6～1.0后，降温至28℃，并加入终浓度为0.15mmol/l的iptg进行诱导培养12h，5000rpm离心收集菌体(即获得重组表达菌株的湿菌体)，用50mmol/lph7.0的磷酸钠缓冲液洗一次，每克菌体重悬于10ml上述磷酸盐缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组表达菌株的粗酶裂解液。取部分上清液进行sds-page蛋白电泳检验表达水平，sds-page电泳结果如图2所示，由图2可知，目标蛋白大小与预期一致。

实施例4

一种酮还原酶在不对称还原制备r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇中的应用，包括以下步骤：

(1)在2l三口烧瓶中加入500ml50mmol/l的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液ph为7.0，搅拌；

(2)再加入实施例3中所述粗酶裂解液200ml，葡萄糖脱氢酶(gdh)2000u(购自sigama)和葡萄糖120g，再加入nadp辅酶0.05g以及前体羰基化合物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮100g，再用磷酸盐缓冲液定容至1l，在30℃温度下反应，用2mol/l的氢氧化钠控制ph，反应16h后用tlc点板检测反应完全，所述nadp辅酶为nadp⁺辅酶；

(3)将反应体系升温至70℃加热1h，加入10g硅藻土过滤除蛋白，用等体积乙酸乙酯(ea)萃取水相和洗涤滤饼2次；

(4)萃取两次后合并有机相，用无水硫酸钠干燥后减压旋烝得油状物粗品，即得r-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇。

测定本实施例粗品的纯度98.0％，摩尔收率97％，e.e.值>99％。

产物e.e.值的hplc具体分析条件为：daicelic-3(250*4.6mm,3μm)；流速1ml/min；流动相：正己烷：异丙醇＝95:5；紫外检测波长254nm；柱温25℃；样品溶于甲醇，浓度5mg/ml；进样体积2ul。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>安徽联创生物医药股份有限公司

<120>酮还原酶及其在不对称合成r-3,5-双（三氟甲基）苯乙醇中的应用

<141>2018-10-31

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>840

<212>dna

<213>incognita

<400>1

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