一株异源表达腈水合酶的大肠杆菌重组菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株异源表达腈水合酶的大肠杆菌重组菌及其应用，属于生物工程
技术领域：
。
背景技术：
：烟酰胺是一种维生素，已经被广泛的用于饲料、食品、制药等行业。烟酰胺市场需求量很大，估计每年需要2000多吨，但目前我国尼克酰胺的生产水平不高，规模不大，需要大量的进口，约1000吨。丙烯酰胺是腈水合酶微生物法生产酰胺类化合物的重要产物之一，同时也是一种用途非常广泛的精细化工原料，在石油、造纸、采矿、纺织、食品等行业均有广泛应用，具有巨大的经济价值。而生产丙烯酰胺的技术，最早是用硫酸水合法，但该法工艺复杂、产品纯化难，且对环境有污染，因此开发新的生产方法一直是相关领域研究的重点方向。目前工业生产中主要用玫瑰色红球菌rhodococcusrhodochrousj1催化生成烟酰胺和丙烯酰胺，采用的是底物分批补料的方式，但是红球菌生长周期较长，需要100h，并且生产效率不高，烟酰胺产量最高为162g/l，而丙烯酰胺产量最高为300g/l。目前也有通过重组菌生产烟酰胺的报道，但终产物浓度较低，只有240g/l。因此，提供一种高产烟酰胺和丙烯酰胺的方法，对于工业制备烟酰胺和丙烯酰胺具有重要的意义。技术实现要素：本发明提供了一株重组来源于嗜热假诺卡氏菌(pseudonocardiathermospinosa)来源的腈水合酶基因的大肠杆菌，高密度发酵重组菌株，并用全细胞催化法生产烟酰胺或丙烯酰胺。本发明的第一个目的是提供一株大肠杆菌重组菌，所述重组菌是异源表达了嗜热假诺卡氏菌来源的腈水合酶，所述腈水合酶的基因序列是由编码氨基酸序列seqidno.1的nhhb基因、如seqidno.4所示的间隔序列a、编码氨基酸序列seqidno.2的nhha基因、如seqidno.5所示的间隔序列b、编码氨基酸序列seqidno.3的nhhp基因依次连接而成。在本发明的一种实施方式中，所述嗜热假诺卡氏菌来源的腈水合酶的核苷酸序列是seqidno.6所示的序列。在本发明的一种实施方式中，以大肠杆菌bl21为宿主。在本发明的一种实施方式中，以pet24a(+)为表达载体。本发明的第二个目的是提供上述重组菌的构建方法，所述方法是将编码氨基酸序列seqidno.1的nhhb基因、如seqidno.4所示的间隔序列a、编码氨基酸序列seqidno.2的nhha基因、如seqidno.5所示的间隔序列b、编码氨基酸序列seqidno.3的nhhp基因依次连接，得到的腈水合酶的基因nhase，将nhase与表达载体连接，转入大肠杆菌中。在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21。在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pet24a(+)。在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：(1)将编码氨基酸序列seqidno.1的nhhb基因、如seqidno.4所示的间隔序列a、编码氨基酸序列seqidno.2的nhha基因、如seqidno.5所示的间隔序列b、编码氨基酸序列seqidno.3的nhhp基因依次连接，得到的腈水合酶的基因nhase；(2)将克隆出的基因连接到pet24a(+)，构建成为重组质粒pet24a-nhhb(rbs)a(rbs)p。(3)将重组质粒转化至大肠杆菌bl21，筛选获得重组大肠杆菌bl21/pet24a-ptnhase。本发明的第三个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在生产烟酰胺或丙烯酰胺中的应用。在本发明的一种实施方式中，所述应用包括以烟腈或丙烯腈作为底物，利用上述重组大肠杆菌进行发酵，发酵后的菌液用于全细胞转化生产烟酰胺或丙烯酰胺。在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌发酵的条件为：将培养6-8h的重组大肠杆菌菌液按5-8％的接种量接种于含卡那霉素浓度为80-120μg/ml的发酵罐培养基中，35-38℃培养，当od600达到70-75时，温度降至28-30℃，以0.20-0.22g/(l·h)的恒速流加140-150ml的诱导剂，诱导培养35-40h结束发酵。在本发明的一种实施方式中，所述发酵罐培养基包括：葡萄糖12.0g/l，磷酸二氢钾13.5g/l，磷酸氢二铵4.0g/l，柠檬酸1.7g/l，硫酸镁1.68g/l，微量元素10ml。在本发明的一种实施方式中，所述微量元素包括：七水硫酸亚铁1.0g/100ml，七水硫酸锌0.525g/100ml，五水硫酸铜0.3g/100ml，四水硫酸锰0.05g/100ml，硼砂0.023g/100ml，氯化钙0.2g/100ml，钼酸铵0.01g/100ml。在本发明的一种实施方式中，利用所述重组大肠杆菌作为全细胞催化剂催化所述底物转化生产烟酰胺的反应条件为：调整温度为25-28℃，烟腈以0.4mol/l的终浓度加入到od600＝150-160.0的发酵液中，当底物反应完毕后再加入下一批底物。在本发明的一种实施方式中，利用所述重组大肠杆菌作为全细胞催化剂催化所述底物转化生产丙烯酰胺的反应条件为：调整温度为25-28℃，丙烯腈以64g/l的终浓度加入到od600＝150-160.0的发酵液中，当底物反应完毕后再加入下一批底物。本发明的第四个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在医药、化工或食品中的应用。本发明的有益效果：本发明通过构建重组大肠杆菌，获得具有高酶活的腈水合酶菌株，重组腈水合酶的纯酶比酶活达907.69u/mg。将重组菌株高密度发酵，以烟腈和丙烯腈作为底物，进行全细胞催化反应制备烟酰胺和丙烯酰胺，烟酰胺的产量达680g/l，丙烯酰胺的产量达514.8g/l。此法与玫瑰色红球菌rhodococcusrhodochrousj1催化生成烟酰胺相比，终产物烟酰胺和丙烯酰胺的产率达95％以上，且简化了产物的分离纯化步骤，发酵周期短，生产效率高。附图说明图1：嗜热假诺卡氏菌来源的腈水合酶全基因片段，其中m为dna分子量标准(250-10000bp)，1为腈水合酶全基因片段；图2：嗜热假诺卡氏菌来源的腈水合酶全基因片段插入质粒pet24a(+)，其中m为dna分子量标准(250-10000bp)，1为重组质粒pet24a-ptnhase；图3：ptnhase蛋白表达的sds-page电泳图，其中m为蛋白分子量标准(6.5-200kda)，1为大肠杆菌bl21pet24a(+)对照菌的细胞破碎液上清；2为大肠杆菌bl21pet24a-ptnhase重组菌诱导后的细胞破碎液上清；图4：全细胞催化生产烟酰胺示意图；图5：全细胞催化生产丙烯酰胺示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。发酵罐培养基(g/l)：葡萄糖12.0，磷酸二氢钾13.5，磷酸氢二铵4.0，柠檬酸1.7，硫酸镁1.68，微量元素10ml。补料培养基(g/l)：葡萄糖500.0，硫酸镁7.33，酵母提取物4.0，胰蛋白胨4.0。诱导剂(g/100ml)：乳糖10.0，cocl2·6h2o0.8。微量元素(g/100ml)：七水硫酸亚铁1.0，七水硫酸锌0.525，五水硫酸铜0.3，四水硫酸锰0.05，硼砂0.023，氯化钙0.2，钼酸铵0.01。细胞密度：uv-1800pc型紫外可见分光光度计测量od600，根据吸光值和od的关系换算，换算关系：1g/l＝0.3683od600。葡萄糖浓度：使用sba-40e生物传感分析仪测定葡萄糖浓度。测发酵液酶活的方法：将100μl，od600＝1.0的菌体(磷酸缓冲液溶解)加入400μl、125mmol/l烟腈溶液中，25℃反应10min，500μl乙腈终止反应，加入终止液后立即在4℃，12000r/min条件下离心1min，吸取上清。反应液经0.22μm微孔滤膜过滤，载入c18色谱柱进行hplc分析，流动相为乙腈水(乙腈：水＝1:2)的混合溶液。烟腈与烟酰胺测定方法：流动相为乙腈水(乙腈：水＝1:2)的混合溶液，流速0.6ml/min，吸光值215nm，采集时间12min。酶活的定义和检测方法：酶活的定义(u)：每分钟转化烟腈生成1μmol/l烟酰胺所需的酶量定义为1u。比酶活(u/mg)：每毫克nhase的酶活。相对酶活的定义：突变酶在ph＝8.4，温度为36℃反应10分钟测得的酶活定义为100％。测腈水合酶酶活的方法：底物为490ul200mm的烟腈，加入浓度为0.5μg/ul的纯酶溶液10ul或od＝10的菌液10ul在36℃的温度下反应10min后用500ul乙腈终止反应，并离心去除沉淀，取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品。烟酰胺或丙烯酰胺含量的检测：采用安捷伦1260进行hplc检测，流动相为水乙腈缓冲液；检测波长210nm，流速为0.6ml/min；色谱柱为c18柱。实施例1重组大肠杆菌bl21/pet24a-ptnhase的构建通过ncbi检索到pseudonocardiathermophila来源的nhase基因序列，通过密码子在线优化网站graphicalcodonusageanalyser进行优化，并在nhhb和nhha基因、nhha和nhhp基因之间加上间隔序列，具体为：将编码氨基酸序列seqidno.1的nhhb基因、如seqidno.4所示的间隔序列a、编码氨基酸序列seqidno.2的nhha基因、如seqidno.5所示的间隔序列b、编码氨基酸序列seqidno.3的nhhp基因依次连接，得到腈水合酶的基因nhase，核苷酸序列如seqidno.6所示，其电泳结果如图1所示，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。优化后的nhase序列中不含酶切位点，设计特异性引物p1、p2，划线部分分别为ndeⅰ和bpu10i限制性内切酶酶切位点。表1引物表p15'-atacatatgtggagtcatccgcagtttgaa-3'p25'-cgaccttagctgcgaactgcc-3'将嗜热假诺卡氏菌来源的腈水合酶基因通过ndeⅰ和bpu10i双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的表达载体pet24(+)上，获得重组质粒pet24-nhhb(rbs)a(rbs)p，其电泳结果如图2所示；将重组质粒转化大肠杆菌bl21，筛选获得重组大肠杆菌bl21/pet24-ptnhase。实施例2腈水合酶的表达将重组大肠杆菌bl21/pet24-ptnhase接种于5ml卡那霉素浓度为100μg/ml的lb培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/ml的lb培养基，37℃、200r/min振荡培养至菌液od600至0.6-0.8，加入iptg至终浓度0.4mmol/l，20℃诱导培养16-20h，收集菌体超声破碎，通过tris-tricinesds-page方法分析鉴定腈水合酶重组蛋白表达水平，结果如图3所示。通过超声破碎，12000rpm离心60min，用亲和层析柱streptrapff纯化蛋白，重组腈水合酶的纯酶的比酶活为907.69u/mg。实施例3重组大肠杆菌高密度发酵将重组大肠杆菌bl21/pet24-ptnhase接种于5ml卡那霉素浓度为100μg/ml的lb培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/ml的lb培养基，37℃、200r/min振荡培养6-8h。将上述培养物按6％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/ml的2l发酵罐发酵培养基中，37℃补料培养，当od600达到60时，温度降至30℃，以0.20-0.22g/(l·h)的恒速流加140-150ml的诱导剂，诱导培养36h结束发酵。发酵结束后酶活达到24763.48u/ml。实施例4全细胞催化法生产烟酰胺将高密度发酵后的菌液离心收集，水洗后再次离心收集。调整温度为25-28℃，烟腈以0.4mol/l的终浓度加入到od600＝150-160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物，用hplc检测反应液中各成分的含量，计算得到烟酰胺的浓度为680g/l，如图4所示。实施例5全细胞催化法生产丙烯酰胺将高密度发酵后的菌液离心收集，水洗后再次离心收集。调整温度为25-28℃，丙烯腈以64g/l的终浓度加入到od600＝150-160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物，用hplc检测反应液中各成分的含量，计算得到丙烯酰胺的浓度为514.8g/l，如图5所示。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一株异源表达腈水合酶的大肠杆菌重组菌及其应用<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>233<212>prt<213>pseudonocardiathermospinosa<400>1metasnglyvaltyraspvalglyglythraspglyleuglyproile151015asnargproalaaspgluprovalpheargalaglutrpglulysval202530alaphealametpheproalathrpheargalaglyphemetglyleu354045aspglupheargpheglyilegluglnmetasnproalaglutyrleu505560gluserprotyrtyrtrphistrpileargthrtyrilehishisgly65707580valargthrglylysileaspleuglugluleugluargargthrgln859095tyrtyrarggluasnproaspalaproleuprogluhisgluglnlys100105110progluleuilegluphevalasnglnalavaltyrglyglyleupro115120125alaserarggluvalaspargproprolysphelysgluglyaspval130135140valargpheserthralaserprolysglyhisalaargargalaarg145150155160tyrvalargglylysthrglythrvalvallyshishisglyalatyr165170175iletyrproaspthralaglyasnglyleuglyglucysprogluhis180185190leutyrthrvalargphethralaglngluleutrpglyproglugly195200205aspproasnserservaltyrtyraspcystrpgluprotyrileglu210215220leuvalaspthrlysalaalaalaala225230<210>2<211>205<212>prt<213>pseudonocardiathermospinosa<400>2metthrgluasnileleuarglysseraspglugluileglnlysglu151015ilethralaargvallysalaleuglusermetleuilegluglngly202530ileleuthrthrsermetileaspargmetalagluiletyrgluasn354045gluvalglyprohisleuglyalalysvalvalvallysalatrpthr505560aspprogluphelyslysargleuleualaaspglythrglualacys65707580lysgluleuglyileglyglyleuglnglygluaspmetmettrpval859095gluasnthraspgluvalhishisvalvalvalcysthrleucysser100105110cystyrprotrpprovalleuglyleuproproasntrpphelysglu115120125proglntyrargserargvalvalarggluproargglnleuleulys130135140gluglupheglyphegluvalproproserlysgluilelysvaltrp145150155160aspserserserglumetargphevalvalleuproglnargproala165170175glythraspglytrpsergluglugluleualathrleuvalthrarg180185190glusermetileglyvalgluproalalysalavalala195200205<210>3<211>144<212>prt<213>pseudonocardiathermospinosa<400>3metseralaglualalysvalargleulyshiscysprothralaglu151015aspargalaalaalaaspalaleuleualaglnleuproglyglyasp202530argalaleuaspargglypheaspgluprotrpglnleuargalaphe354045alaleualavalalaalacysargalaglyargpheglutrplysgln505560leuglnglnalaleuileserserileglyglutrpgluargthrhis65707580aspleuaspaspprosertrpsertyrtyrgluhisphevalalaala859095leugluservalleuglyglugluglyilevalgluproglualaleu100105110aspgluargthralagluvalleualaasnproproasnlysasphis115120125hisglyprohisleugluprovalalavalhisproalavalargser130135140<210>4<211>31<212>dna<213>人工合成<400>4ctgttgaatataagaataaggaggtatttta31<210>5<211>21<212>dna<213>人工合成<400>5tgaatattaaggaggttattt21<210>6<211>1807<212>dna<213>人工合成<400>6atgaatggcgtttatgatgttggtggcaccgatggtctgggtccgattaatcgcccggcc60gatgaaccggtttttcgcgccgaatgggaaaaagttgcatttgccatgtttccggcaacc120tttcgcgcaggttttatgggtctggatgaatttcgttttggcattgaacagatgaatccg180gcagaatatctggaaagtccgtattattggcattggattcgtacctatattcatcatggc240gtgcgtaccggtaaaattgatctggaagaactggaacgtcgtacccagtattatcgtgaa300aatccggatgccccgctgccggaacatgaacagaaaccggaactgattgaatttgtgaat360caggccgtttatggcggcctgccggcaagccgtgaagttgatcgtccgccgaaattcaaa420gaaggtgacgtggtgcgctttagcaccgccagtccgaaaggccatgcacgtcgtgcccgc480tatgtgcgtggcaaaaccggtaccgtggttaaacatcatggtgcatatatctatccggat540accgccggtaatggcctgggtgaatgtccggaacatctgtataccgttcgctttaccgca600caggaactgtggggcccggaaggtgacccgaatagtagtgtttattatgattgctgggag660ccgtatattgaactggtggataccaaagcagcagccgcataactgttgaatataagaata720aggaggtattttaatgaccgaaaacatcctgcgtaaaagcgatgaagaaattcagaaaga780aatcaccgcccgcgttaaagccctggaaagtatgctgattgaacagggcattctgaccac840cagtatgattgatcgtatggccgaaatctatgaaaatgaagttggcccgcatctgggcgc900caaagtggtggttaaagcctggaccgatccggagtttaaaaaacgcctgctggccgatgg960caccgaagcatgtaaagaactgggcattggtggcctgcagggcgaagatatgatgtgggt1020ggaaaataccgatgaagtgcatcatgtggtggtttgtaccctgtgcagttgctatccgtg1080gccggttctgggcctgccgccgaattggtttaaagaaccgcagtatcgcagccgtgttgt1140gcgtgaaccgcgtcagctgctgaaagaagaatttggttttgaagttccgccgagtaaaga1200aattaaggtttgggatagcagcagcgaaatgcgttttgtggtgctgccgcagcgtccggc1260cggtacagatggttggagcgaagaagaactggccaccctggtgacccgcgaaagtatgat1320tggtgttgaaccggccaaagcagtggcatgatgaatattaaggaggttatttatgagcgc1380tgaagccaaagtgcgtctgaaacattgtccgaccgccgaagatcgcgccgccgcagatgc1440actgctggcacagctgccgggcggcgaccgcgcgctcgatcgcggttttgatgaaccgtg1500gcagctgcgcgcctttgccctggccgtggccgcctgtcgcgccggccgctttgaatggaa1560acagctgcagcaggccctgattagcagtattggcgaatgggaacgtacccatgatctgga1620tgatccgagctggagctattatgaacattttgtggccgcactggaaagtgtgctgggcga1680agaaggtattgttgaaccggaagcactggatgaacgcaccgccgaagttctggccaatcc1740gccgaataaggatcatcatggcccgcatctggaaccggttgcagtgcatccggcagttcg1800cagctaa1807当前第1页12