本发明属于基因
技术领域：
，特别是一种利用crispr-cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法。
背景技术：
：crispr是一种来自细菌降解入侵的病毒dna或其他外源dna的免疫机制。目前，crispr-cas9系统应用最为广泛。cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割dna两条单链。cas9首先与crrna及tracrrna结合成复合物，然后通过pam序列结合并侵入dna，形成rna-dna复合结构，进而对目的dna双链进行切割，使dna双链断裂。由于pam序列结构简单(5’-ngg-3’)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。crispr-cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，腺病毒载体法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一。载体容易构建和操作，宿主范围广，感染性强，腺病毒载体能有效地将外源基因转移到各种靶细胞或组织中。可经不同途径进入不同组织，能感染分化后的非分裂期细胞，并且腺病毒基因不整合到宿主细胞中，无插入突变激活癌基因的危险，外源基因能游离地表达。近年，腺病毒载体引起了科研人员的关注，广泛用于遗传病、传染病和肿瘤等疾病的基因治疗的研究和应用。肿瘤具有多基因型的特征，且基因变异驱使肿瘤的恶性发展和化疗耐药，纠正或删除这些变异基因是未来肿瘤治疗发展的一个方向。胶质瘤是源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的颅内恶性肿瘤。年发病率为3～8人/10万人口。目前，胶质瘤化疗所选用的主要药物为吉非替尼、厄洛替尼、奥斯替尼等，但在长期使用过程中，部分胶质瘤肿瘤细胞由于基因片段的损伤、突变，产生了耐药性，导致肿瘤化疗失败。经研究发现，导致胶质瘤肿瘤细胞产生耐药性的基因片段主要有mdr1，通过采用基因编辑、敲除等技术，能够敲除这些基因，培育出缺失mdr1等基因片段，从而对上述药物缺乏耐药性的肿瘤细胞模型，是一种胶质瘤的基因治疗的有效辅助手段。然而，目前的基因敲除中，尚未发现有关敲除mdr1基因片段，建立肿瘤模型的技术。技术实现要素：本发明提供了一种利用crispr-cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，具体通过以下技术实现。一种利用crispr-cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，包括以下步骤：a1、取动物胶质瘤肿瘤细胞冻存细胞进行单克隆培养，得胶质瘤肿瘤细胞悬液，备用；a2、针对mdr1中的蛋白质编码序列，通过crispr在线设计工具分别设计针对于mdr1的sgrna；所述mdr1的基因序列如seqidno.1所示；a3、将各sgrna分别插入到腺病毒载体中，使其能表达，得重组腺病毒载体；a4、将重组腺病毒载体转染至转染细胞中，直至出现明显细胞病变后，收集细胞，冻融释放病毒，在转染细胞中连续pcr扩增，获得大量病毒液，分层纯化病毒液，得高浓重组腺病毒载体；a5、将高浓重组腺病毒载体加至胶质瘤肿瘤细胞悬液中，敲除胶质瘤肿瘤细胞的mdr1基因，得动物肿瘤模型。优选地，步骤a3中，所述腺病毒载体含有绿色荧光标签蛋白。优选地，针对于mdr1的各自所述sgrna序列的设计选择在第一外显子。优选地，所述腺病毒载体为ad5f35腺病毒载体。优选地，步骤a4的所述转染细胞为hek293转染细胞。优选地，所述pcr引物为：正向引物为5'-gcagggcgtgagcattagat-3'，反向引物为5'-gagttggcgacaaggacagaa-3'。与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明采用crispr/cas9基因编辑技术构建的胶质瘤肿瘤模型，敲除了容易产生突变而致使胶质瘤肿瘤细胞产生耐药性的基因片段mdr1，大大延缓了胶质瘤肿瘤细胞的耐药性产生的时间，同时也降低了胶质瘤肿瘤细胞的耐性程度；为日后对于人类胶质瘤诊断、预后以及治疗方面势提供思路，帮助人们更精确地研究胶质瘤肿瘤的耐药机理，研发更有效的抗肿瘤靶向药。具体实施方式下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1一种利用crispr-cas9基因编辑技术构建肿瘤模型的方法，包括以下步骤：a1、取胶质瘤肿瘤细胞冻存细胞进行单克隆培养，得胶质瘤肿瘤细胞悬液，备用；选用上海康朗生物科技有限公司的shg-44人胶质瘤肿瘤细胞冻存细胞，培养基选用rpmi-1640+10％胎牛血清培养基和dmem-1640+15％胎牛血清培养基；对肿瘤细胞进行细胞复苏、细胞传代，制备获得胶质瘤肿瘤细胞悬液。a2、针对mdr1中的蛋白质编码序列，通过crispr在线设计工具分别设计针对于mdr1的sgrna；所述mdr1的基因序列如seqidno.1所示；a3、将sgrna插入到ad5f35腺病毒载体(汉恒生物科技(上海)有限公司)中，使其能表达，得重组ad5f35腺病毒载体；a4、将重组ad5f35腺病毒载体转染至hek293转染细胞中，直至出现明显细胞病变后，收集细胞，冻融释放病毒，在hek293转染细胞中连续pcr扩增，获得大量病毒液，分层纯化病毒液，得高浓重组ad5f35腺病毒载体；转染的具体方法为:将dmem在37℃水浴锅中预热15min，同时将转染试剂lipofectamine2000放置室温平衡30min。观察前一天铺的细胞密度，达到80％左右可以开始转染。将高浓重组ad5f35腺病毒载体以质量浓度比为1:1.5的比例按照lipofectamine2000说明书转染hek293转染细胞(北京义翘神州科技有限公司)。a5、将高浓重组ad5f35腺病毒载体加至胶质瘤肿瘤细胞悬液中，敲除胶质瘤肿瘤细胞的mdr1基因，得胶质瘤肿瘤模型。应用例1：实施例1制备的胶质瘤肿瘤模型的药物试验设空白对照，取3份上海康朗生物科技有限公司的shg-44人胶质瘤肿瘤细胞冻存细胞，经细胞复苏和传代，制备成胶质瘤肿瘤细胞悬液；然后，在这3份胶质瘤肿瘤细胞悬液中分别加入浓度为20μg/ml的吉非替尼、厄洛替尼、奥斯替尼，3d后将培养基中残余的胶质瘤肿瘤细胞继续扩大培养，以此重复3次，最后取存活的胶质瘤肿瘤细胞进行再次扩大培养，制得具有耐药性的空白对照胶质瘤肿瘤细胞。取3份实施例1制备的胶质瘤肿瘤，在实施例1和空白对照中分别加入浓度为20μg/ml的吉非替尼、厄洛替尼、奥斯替尼。药物试验结果如下表1所示。表1实施例1制备的胶质瘤肿瘤模型耐药性log吉非替尼厄洛替尼奥斯替尼实施例1(1)2.15————实施例1(2)——1.93——实施例1(3)————2.47空白对照(1)-0.28————空白对照(2)——-0.82——空白对照(3)————-0.44表1中，数值为正值，说明肿瘤细胞的耐药性越弱，数值为负值，说明肿瘤细胞的耐药性越强。由上表1可知，与具有耐药性的空白对照相比，实施例1制备胶质瘤肿瘤细胞模型的耐药性很弱，对吉非替尼、厄洛替尼、奥斯替尼非常敏感。应用例1：各个浓度的吉非替尼对实施例1制备的胶质瘤肿瘤模型的杀伤情况将吉非替尼设置10、15、20、25、30μg/ml共5个浓度梯度，分别加至5份实施例1制备的胶质瘤肿瘤细胞模型中，杀伤情况见下表2。表2不同浓度的吉非替尼对实施例1制备的胶质瘤肿瘤细胞模型的杀伤情况10μg/ml15μg/ml20μg/ml25μg/ml30μg/ml实施例128.32％22.68％15.32％8.61％4.22％表2中，百分数越大，说明存货的胶质瘤肿瘤细胞数量越多，说明其需要更大剂量的吉非替尼药物。序列表<110>武汉纤然生物科技有限公司<120>一种利用crispr-cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法<141>2018-11-08<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2003<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cccagtctctacgaaaaatacaaaaaattagccgggcgtggtggcgggagcctgtagtcc60cagctacctgggaggctgaggcaggagaatggtgtgaacccgggaggcggagcttgcagt120gagccgagatcctgccactgcactccagcctgggcgacaaagcaagactccgtctcaaaa180aagaaaaaagaaagaaaaacaaaagaaaacttcattgtattgtaaggccaagaacaaaat240atatcaagataaggaaaatttgtagtcaagaatagaaaaaaattatggctttgaagtatg300agttatttaaagaaagtggaaacatcctcagactatgcagtaaaaaacaaagtgattttc360ttcttctaaacttatgcaataaactgataggtaatatgtgaaagtcatagaatgtagact420agaggatacaacaaacctatttcctctatgttcataagaagtaagaaaagctctgatgtg480agttagcattgctttacaattttgaattgtgcagattgcacgtacttttcctcagtttga540agtaaatagtggacaggaaaaaatattaaatgttggcagtaaatatggaaggaaattaca600actaatgtaatatgctaaaacatgctatgtttattttactaatttgaattaaaatgtaag660aatttaaaatgccctggaaaaacacgggcattgatctgacgtctgaagttttaaaatatt720acacactttgaaatagcatttgtaccttgaaatacctgtctctatatattttttaaaact780tcctttttctttcattccatttatcatcaaataaaggatgaacagatgtaactcagaaac840tgtcaagcatgctgaagaaagaccactgcagaaaaatttctcctagccttttcaaaggtg900ttaggaagcagaaaggtgatacagaattggagaggtcggagtttttgtattaactgtatt960aaatgcgaatcccgagaaaatttcccttaactacgtcctgtagttatatggatatgaaga1020cttatgtgaactttgaaagacgtgtctacataagttgaaatgtccccaatgattcagctg1080atgcgcgtttctctacttgccctttctagagaggtgcaacggaagccagaacattcctcc1140tggaaattcaacctgtttcgcagtttctcgaggaatcagcattcagtcaatccgggccgg1200gagcagtcatctgtggtgaggctgattggctgggcaggaacagcgccggggcgtgggctg1260agcacagccgcttcgctctctttgccacaggaagcctgagctcattcgagtagcggctct1320tccaagctcaaagaagcagaggccgctgttcgtttcctttaggtctttccactaaagtcg1380gagtatcttcttccaaaatttcacgtcttggtggccgttccaaggagcgcgaggtagggg1440cacgcaaagctgggagctactatgggacagttcccaagtgtcaggctttcagatttcctg1500aacttggtcttcacgggagaagggcttcttgaggcgtggatagtgtgaagtcctctggca1560agtccatggggaccaagtggggttagatctagactcaggagctcctggagcagcgcccaa1620accgtagtggcactggaccatgttgcccggagcgcgcacagcccgcgcggtgcggggacc1680tgctctctgagcccgcgggcggtgggtgggaggaagcatcgtccgcggcgactggaaccg1740ggagggagaatcgcactggcggcgggcaaagtccagaacgcgctgccagacccccaactc1800tgccttcgtggagatgctggagaccccgcgcacaggaaagcccctgcagtgcccatcgcg1860gccagagcagctggggcatcaacggcgggcgctccctcttactgctctctggcttcgacg1920ggggactagaggttagtctcacctccagcgcgcctgaggctcatgcatttggctaatgag1980ctgcggtttctcttcaggtcgga2003当前第1页12