伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用的制作方法

本发明属于动物医学的疫苗领域，具体涉及伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用。
背景技术：
：伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的一种急性、烈性传染病。牛、羊等家畜和犬、猫以及野生动物发生伪狂犬病时常表现为神经症状和奇痒等典型症状，伴有发热和脑脊髓炎等临床症状。猪是伪狂犬病病毒的唯一储存宿主，猪伪狂犬病的症状与年龄相关，新生仔猪有神经症状，死亡率高；育肥猪主要是呼吸道症状，成年猪感染伪狂犬病毒后生长停滞，通常不发生死亡，母猪常发生流产，公猪发生睾丸炎，病毒可以通过精液传播。prv基因缺失株疫苗(如ge基因缺失的barthak61株等)配合鉴别免疫猪与野毒感染猪的prvge抗体的elisa检测方法能简便地诊断出是否有野毒感染，可以通过持续淘汰阳性种猪建立净化场，经过10多年的努力，世界上许多国家实现了在家养猪群中伪狂犬病病毒的净化，在我国，2000年之后，许多猪场也逐步成功建立了prvge抗体阴性的猪群，不少猪场基本实现了prv的净化，猪伪狂犬病得到了较好控制。自2011年以来，我国北方许多猪场大规模出现猪伪狂犬病疫情，之后疫情迅速向全国大部分养猪场蔓延，虽然猪场采取了强化免疫等措施，但prvge抗体阳性率居高不下，对我国养猪业造成严重危害。多个团队的研究结果证明此轮疫情是由变异的prv野毒株引起，该变异株致病性显著增强，传统疫苗株barthak61株虽然能提供临床保护，但不能阻止免疫接种动物的排毒。技术实现要素：本发明的目的是提供伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株，该毒株能够很好的适应st细胞，滴度高，由于该弱毒疫苗株是对barthak61株进行的改造，因此安全性较高。本发明的另一目的是提供含有伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株伪狂犬病疫苗，采用该疫苗免疫后能够对免疫猪只提供100％保护，该疫苗不但能阻止发病，还能显著降低排毒率、大幅减少排毒量，排毒时间大大缩短，而且由于该毒株应用经典疫苗株barthak61株为骨架，所以该重组弱毒株的安全性好。本发明的目的采用如下技术方案实现。伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株，是将伪狂犬病病毒barthak61株基因组中的gc基因替换为伪狂犬病病毒ah02la株的gc基因、gd基因替换为伪狂犬病病毒ah02la株的gd基因后获得的，所述伪狂犬病病毒ah02la株的gc基因序列如seqidno:1所示，所述伪狂犬病病毒ah02la株的gd基因序列如seqidno:2所示。本发明还提供所述伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株在制备伪狂犬病疫苗中的应用。本发明还提供以所述伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株为活性成分的疫苗。在本发明中，伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株病毒液采用如下方法制备：将伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株接种st细胞，采用含有胎牛血清的dmem培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液作为伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株病毒液。在本发明中，所述疫苗为活疫苗。疫苗内可以加入免疫佐剂与疫苗赋形剂等，本领域技术人员可以容易地进行生产。本发明还提供一种重组载体活疫苗，其活性成分是在所述伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株基因组中插入了外源保护性抗原基因表达盒后得到的。启动子可以选择pmcmvie、sv40和phcmvie等，外源基因的插入位点包括基因组的ul22与ul21之间、ul46与ul27之间、ul51与ul50之间、ul35与ul36之间、ul40与ul41之间、ul44与ul26.5之间和ul4与ul3.5之间的非编码区，插入的外源基因包括猪瘟病毒的e蛋白基因、猪圆环病毒的cap蛋白基因、狂犬病病毒的g蛋白基因、口蹄疫病毒的vp1基因、猪流感病毒的ha基因和兔瘟病毒的vp60基因等。申请人通过大量富有创造性的劳动，获得了伪狂犬病病毒gd和gc基因重组弱毒株(b-gd&gcs株)。b-gd&gcs株是以barthak61株为骨架，其gb、gg、gh、gk、gl、gm和gn基因与barthak61完全一致(genbankid:jf797217.1)；其gc和gd基因是采取基因工程方法将变异株基因替换而得，与ah02la株完全一致(gc基因序列为seqidno:1；gd基因序列为seqidno:2)，均与现公开变异毒株高度同源。本发明b-gd&gcs株是首先构建prvbarthak61株的细菌人工染色体，然后将gd基因替换为变异株ah02la株的gd基因，最后再将其gc基因替换为变异株ah02la株的gc基因，同时拯救病毒而得。伪狂犬病病毒b-gd&gcs株能够很好地适应st细胞，生长滴度达108.0tcid50/ml以上。伪狂犬病病毒b-gd&gcs株的活疫苗接种断奶prv阴性仔猪后能快速产生高效保护力，无体温反应，无临床症状，对伪狂犬病病毒变异株100％保护，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒或排毒量大幅减少，排毒时间大大缩短，取得了意想不到的技术效果。接种伪狂犬病病毒b-gd&gcs株后进行攻毒保护试验结果表明，可以通过对prvge和gb抗体进行监测区分免疫该疫苗的动物与感染动物，非常有利于对prv变异株的净化。将其用作活载体表达猪易感病原的保护性抗原，还能达到接种一针防两种或多种疫病的效果。由于b-gd&gcs株的骨架为广泛使用的、安全性高的barthak61株，因此是一株安全性可靠的疫苗候选弱毒株。附图说明图1、伪狂犬病病毒b-gd&gcs株构建示意图。(a)通过同源重组将mini-f插入prvbarthak61株gc基因的等位位点。(b)通过第一轮重组将含卡那霉素抗性基因的ah02la株gd基因替换bartha株的gd基因，然后第二轮重组将卡那霉素抗性基因敲除，构建成功gd替换株克隆(bacpb-gds-mini-f)。(c)再次通过同源重组将bacpb-gds-mini-f中的mini-f序列替换为ah02la株的gc基因，构建成gc和gd双替换株(即prvb-gd&gcs株)。图2、转移载体pha2-puc19-h1b-h2b的结构图，egfp为荧光蛋白表达盒。图3、488nm紫外光激发下b-mini-f株的电镜照片，图中所示为在紫外光激发下发出荧光的mini-f重组prvbarthak61株(即prvb-mini-f株)病毒蚀斑。图4、prvbarthak61bac及其重组子的rflp图。左侧图示为pb-mini-f株(脉道1和4)、bacpb-gds-kan-mini-f株(脉道2和5)和bacpb-gds-mini-f株(脉道3和6)dna的rflp图谱，分别经hindiii(脉道1–3)酶切或sphi酶切(脉道4–6)，箭头所示为发生大小变化的条带。右图所示为参考株(barthak61株)序列(genbankid:jf797217.1)rflp分析的预测图谱，自下而上mark条带大小是1k、2k、5k、10k和100m。图5、伪狂犬病病毒gd和gc基因重组弱毒株(b-gd&gcs株)pcr鉴定图。左图所示为barthak61株和prvb-gd&gcs株gd基因的pcr鉴定电泳图(所用引物为ah02la-gd-f/ah02la-gd-r)。右图所示为barthak61株和prvb-gd&gcs株gc基因的pcr鉴定电泳图(所用引物为seq-ah02lagcf/seq-ah02lagcr)。图6、伪狂犬病病毒gd和gc基因重组弱毒株(b-gd&gcs株)病毒蚀斑。上图圆圈内所示为prvb-gds-mini-f株病毒蚀斑(紫外光激发下)，下图正方形内所示为prvb-gd&gcs病毒蚀斑(白光下)。图7、prvb-gd&gcs株和亲本病毒(prvbarthak61株)的体外生长特性比较。具体实施方式以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本发明的范围和精神并不限于所列实施例。实施例一、伪狂犬病病毒barthak61株的细菌人工染色体构建1、转移载体的获得为将mini-f载体插入伪狂犬病病毒prvbarthak61株的gc基因等位位点(图1)，设计gc基因上、下游同源臂引物(bartha-gc-h1-f/r和bartha-gc-h2-f/r)(表1)，通过pcr获得序列，再通过酶切和连接到puc19载体上，然后再连接mini-f载体(图2)，得到转移载体。表1pcr和测序引物首先以伪狂犬病病毒barthak61株(猪场送检鼻拭子样品分离而得)的dna为模板，pcr扩增gc基因(barthak61株基因组中的第53193-第54635位核苷酸序列)的上游同源臂片段h1，pcr反应体系(表2)和反应程序如下。表225μlpcr反应体系样品体积lataqdna聚合酶0.25μl2×gcbufferii12.5μldntps(2.5mm)4μl上游引物bartha-gc-h1-f1μl下游引物bartha-gc-h1-r1μl模板dna1μlddh2o5.25μlpcr反应体系中的lataqdna聚合酶、2×gcbufferii购自takara公司，引物序列见表1。将反应体系混匀，进行pcr扩增，反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸10min。将pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，发现存在1200bp左右的目的条带并将其切下，采用dna凝胶回收试剂盒回收，经酶切后连接到puc19载体上，获得puc19-h1。然后，以伪狂犬病病毒barthak61株的dna为模板，应用引物bartha-gc-h2-f和bartha-gc-h2-r，按上述相同方法扩增gc基因(barthak61株基因组中的第53193-第54635位核苷酸序列)下游同源臂片段h2，并将下游同源臂片段h2连接到puc19-h1上，获得puc19-h1-h2。将puc19-h1-h2质粒dna与pha2质粒dna(公开于wangetal；virusresearch159(2011)23-31,generationofaninfectiouscloneofduckenteritisvirus(dev)andofavectoreddevexpressinghemagglutininofh5n1avianinfluenzavirus)分别采用paci酶切，连接后获得转移载体质粒pha2-puc19-h1b-h2b。如图2所示，转移载体质粒pha2-puc19-h1b-h2b中的上、下游同源臂之间有荧光蛋白表达盒，转移载体序列符合预期。2、pha2重组伪狂犬病病毒barthak61株的获得应用9～10日龄spf鸡胚制备原代鸡胚成纤维细胞(chickenembryofibroblasts，cef)，细胞长成单层后，进行转染。按照常规磷酸钙转染法进行转染，将0.5～1μg转移载体质粒pha2-puc19-h1b-h2bdna与0.2～1μg伪狂犬病病毒barthak61株的dna共转染原代cef，进行同源重组，24小时后吸除培养液，加入含10％胎牛血清和0.5％甲基纤维素的dmem培养基覆盖，继续培养24～48h，挑取在波长为488nm紫外光激发下发出绿色荧光的重组病毒蚀斑(图3)，接种到新鲜的cef，如此重复3个循环以上，获得纯化的重组病毒，命名为prvb-mini-f株。因此，prvb-mini-f株是将伪狂犬病病毒prvbarthak61株的gc基因替换成了mini-f载体后得到的。3、伪狂犬病病毒barthak61株细菌人工染色体的获得与鉴定取1～3μg重组病毒b-mini-f株的dna，通过电转化转入感受态细胞e.colidh10b(购自invitrogen公司)，提取阳性克隆的dna，经hindiii和sphi分别酶切后进行rflp分析，表明与预测图谱吻合，再提取dna，再次通过电转化转入感受态细胞e.coligs1783中，取其中一个克隆，提取dna，应用同样方法经hindiii和sphi分别酶切后进行rflp分析(见图4)，结果与预测图谱吻合，将该克隆命名为pb-mini-f株。实施例二、伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株的构建与鉴定1、prvah02la株gd基因的克隆与鉴定为将重组菌pb-mini-f中的gd基因替换为伪狂犬病病毒变异株ah02la株的gd基因序列，以伪狂犬病病毒变异株ah02la株(保藏编号为cgmccno.10891)dna为模板，以ah02la-gd-f和ah02la-gd-r为引物对伪狂犬病病毒变异株ah02la株的gd基因(seqidno:2)进行pcr扩增，pcr反应体系(表3)和反应程序如下。表325μlpcr反应体系样品体积lataqdna聚合酶0.25μl2×gcbufferii12.5μldntps(2.5mm)4μl上游引物ah02la-gd-f1μl下游引物ah02la-gd-r1μl模板dna1μlddh2o5.25μlpcr反应体系中的lataqdna聚合酶、2×gcbufferii购自takara公司，引物序列见表1。将反应体系混匀，进行pcr扩增，反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸2min10s，30个循环；72℃延伸10min。将pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，将目的条带连接到t载体pmd19((购自takara)上，获得pmd19-gda，经南京金斯瑞生物科技有限公司测序验证。为了将pb-mini-f株中的gd基因替换为伪狂犬病病毒变异株ah02la株的gd基因，应用一对引物kaninsgdf和kaninsgdr(表1)，以pdevc-kce-h5(ul55)kandna为模板(公开于wangetal；virologyjournal(2015)12:126，constructionofarecombinantduckenteritisvirus(dev)expressinghemagglutininofh5n1avianinfluenzavirusbasedonaninfectiouscloneofdevvaccinestrainandevaluationofitsefficacyinducksandchickens)，pcr扩增一端带有ah02la株gd基因中部分片段c的卡那霉素抗性基因(缩写为c-sm片段，即图1中(b)第一条序列两个*之间的部分，其中sm是卡那霉素抗性基因的缩写)，pcr反应体系(表4)和反应程序如下。表425μlpcr反应体系样品体积lataqdna0.25μl2×gcbufferii12.5μldntps(2.5mm)4μl上游引物kaninsgdf1μl下游引物kaninsgdr1μl模板dna1μlddh2o5.25μlpcr反应体系中的lataqdna聚合酶、2×gcbufferii购自takara公司，引物序列见表1。将反应体系混匀，进行pcr扩增，反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸2min10s，30个循环；72℃延伸10min。将pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带(c-sm片段)经saci酶切后连接到也经saci酶切的pmd19-gda片段上，即将c-sm片段插入ah02la株gd基因内部、且sm片段两端序列均为片段c。将获得的阳性克隆经南京金斯瑞生物科技有限公司测序验证，命名为pmd19-gda-kan。2、gd重组pb-mini-f的bac重组子的获得与鉴定首先以pmd19-gda-kan的dna为模板，应用一对引物barthainsgda-kanf和barthainsgda-kanr进行pcr，扩增内部插入了卡那霉素抗性基因的ah02la株gd基因片段，该片段两端分别带有barthak61株gd基因(barthak61株基因组中第119436-第120638位核苷酸序列)上游和下游40bp的同源序列(见图1中(b)部分的第一条片段)。pcr片段经回收和dpni酶切后电转入含pb-mini-f的gs1783的感受态细胞进行第一轮同源重组，将barthak61株gd基因替换成内部插入了卡那霉素抗性基因的ah02la株gd基因片段(图1)，获得的阳性克隆命名为：bacpb-gds-kan-mini-f。接着内部插入了卡那霉素抗性基因的ah02la株gd基因片段内部进行第二轮重组，由于该片段中sm片段两端均是片段c，因此第二次同源重组时，敲除了一个c片段和卡那霉素抗性基因，筛选对氯霉素有抗性，而对卡拉霉素没有抗性的阳性单克隆，命名为bacpb-gds-mini-f。该阳性单克隆，经hindiii和sphi酶切后进行rflp图谱分析，与预期相附(图4)。替换后的gd基因经pcr和测序验证，与ah02la株一致。3、伪狂犬病病毒gd和gc重组株的获得与鉴定首先以prvah02la株的dna为模板，应用引物bartha-gc-h1-f和bartha-gc-h2-r进行pcr扩增，获得ah02la株gc基因片段(seqidno:1)，其两端序列与bacpb-gds-mini-f中mini-f两端序列具有同源性，将回收的扩增片段与bacpb-gds-mini-f的dna共转染st细胞，在拯救病毒的同时，将bacpb-gds-mini-f中的mini-f替换为变异株ah02la株的gc基因(图1中(c))。转染后1～2天在紫外光(488nm)激发下观察，观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑为gc未替换的病毒，挑斑纯化获得一株病毒，命名为prvb-gds-mini-f株。观察到不发出荧光的病毒蚀斑(图6)，经3轮挑斑，获得一株纯化的病毒，命名为prvb-gd&gcs株。b-gd&gcs株的gd和gc基因经pcr和测序验证(图5)，与变异株ah02la株一致。综上所述，将伪狂犬病病毒barthak61株基因组中的gc基因替换为伪狂犬病病毒ah02la株的gc基因(seqidno:1)、gd基因替换为伪狂犬病病毒ah02la株的gd基因(seqidno:2)后，得到了prvb-gd&gcs株。实施例三、prvb-gd&gcs株的生长特性鉴定将prvb-gd&gcs株和prvbarthak61株分别以moi为0.01接种长满单层的st细胞上，置5％co2恒温培养箱中37℃孵育1h后，吸去上清液，应用pbs洗涤3次后，换成细胞维持液(含3％胎牛血清(fbs)的dmem培养基(gibco))进行培养，并分别于接种后0h、6h、12h、24h、36h、48h和72h收集培养物上清和细胞混合物，经-70℃和37℃冻融后，5000rpm离心10min取上清，接种长成单层的新鲜st细胞，检测病毒的tcid50，共重复3次。制作病毒的生长曲线。从病毒的生长曲线(图7)可以看出，prvb-gd&gcs株与prvbarthak61株具有相似的生长动力学，两者比较无显著差异。在接种后36h～48h都达到峰值，滴度都达到108.0tcid50/ml以上，能满足活疫苗生产的要求。实施例四、prvb-gd&gcs株的安全性和免疫效力1、试验材料1.1病毒与伪狂犬病活疫苗prvb-gd&gcs株病毒液(同实施例三)，病毒含量为108.25tcid50/ml。制备方法如下：将prvb-gd&gcs株接种st细胞，采用含有3％胎牛血清的dmem培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液即得病毒液。伪狂犬病活疫苗(barthak61株)，病毒含量为108.50tcid50/ml。prvah02la株，用于攻毒试验，病毒含量为107.00tcid50/ml。1.2诊断试剂盒prvge抗体诊断试剂盒、prvgb抗体诊断试剂盒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)抗体诊断试剂盒和猪瘟病毒(sfv)抗体诊断试剂盒，均购自北京爱德士元亨生物科技有限公司(idexx)公司。2、试验动物28～35日龄健康仔猪20头，其prv抗原和prvge与gb抗体均为阴性，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)和猪瘟病毒(sfv)抗原与抗体均为阴性。接种前核实猪只的饮食、精神状况和临床情况等，凡不健康的猪只排除出试验。通过耳标号码和笼号与圈号进行标识。在隔离环境中分笼饲养。饲料为全价配合饲料(市售产品)，饮水为自来水，每日上午和下午各饲喂一次。专人负责饲养，每天进行2次清洁卫生。3、分组试验动物一次引入，随机分为a～d组，每组5头，具体见表5。4、试验方法和研究的指标(1)试验方法免疫：将prvb-gd&gcs株病毒液和prvbarthak61株病毒液分别应用无菌dmem培养液稀释至106.00tcid50/2ml用于免疫，免疫方式均为肌肉注射，免疫剂量为2ml/头。a组接种prvb-gd&gcs株，b组接种prvbarthak61株，c组(攻毒对照组)接种2mldmem液，d组不接种为阴性对照组(表5)。攻毒：除阴性对照组外的所有猪只于疫苗接种后1周攻毒，应用prvah02la株，以2ld50/头滴鼻攻毒，每头2ml，攻毒后观察14天。血清gb和ge抗体检测：免疫前、攻毒前和攻毒结束时(即攻毒后14天)三个时间点采取所有猪只血清样品，应用试剂盒检测prvge和gb抗体。临床症状观察：所有试验猪只每日观察精神、饮食状况和各种呼吸系统、神经系统和全身性临床表现。体温测量：从疫苗接种前开始，至试验结束(攻毒后14天)，所有猪只每日测量体温一次(直肠温度)。排毒情况检测：攻毒前、攻毒后至试验结束(攻毒后14天)，每天采集猪只鼻拭子样品，样品置-70℃保存，检测时倍比稀释后接种bhk-21细胞观察病变以确定是否排出病毒，以及排毒的滴度。(2)研究的指标发病率、死亡率、体温升高情况、排毒情况、血清抗体阳转情况，肺部病变。5、试验结果疫苗接种前所有试验猪的prvgb和ge抗体均为阴性，阴性对照组(d组)猪只至试验结束时的prvgb和ge抗体均为阴性，疫苗接种后1周时(即攻毒前)a组和b组的所有试验猪的prvgb抗体均为阳性，攻毒后所有免疫组猪和攻毒对照组存活猪的prvge抗体均为阳性(表5)。攻毒后，阴性对照组(d组)猪只无发病死亡，无体温升高，未检出排毒(数据省略)；攻毒对照组5头猪从攻毒后第2天开始全部出现减食，精神沉郁，打喷嚏，流鼻涕和呼吸困难等症状，体温都升高到40.5℃以上，均从鼻拭子样品中检出排毒，排毒量达101.30～108.83/克，在攻毒后第5、6和7日各死亡1头，死亡猪和存活猪(攻毒后14日)剖检均见有肺部典型出血病变，表明试验对照成立。攻毒后，a组和b组试验猪均无临床症状，无体温升高，a组、b组和d组试验猪剖检肺部未见典型病变，c组所有试验猪剖检肺部均见有典型的出血病征(表5)。b组猪在攻毒后全部发生排毒，排毒滴度最高达109.82tcid50/克，排毒持续期最长达10天；而a组猪在攻毒后有2头未发生排毒，另3头发生排毒，排毒滴度最高为106.19tcid50/克，较b组显著下降，排毒时间不超过7天，较b组明显缩短(表6)。上述实验结果表明prvb-gd&gcs株对变异株感染后的排毒保护比barthak61株有显著提高，非常有利于变异株的防控和净化。表5安全性和免疫效力试验结果注：表5中b.v.指疫苗接种前；p.v.指疫苗接种后；p.c.指攻毒后；gb+指prvgb抗体阳性；ge+指prvge抗体阳性；“/”指不适用；“a”指阳性猪数量；“b”指组内试验猪总数。表6攻毒后a、b、c组排毒结果注：表6中“/”表示不适用；“-”表示未检出排毒；病毒滴度为tcid50/克。综上所述，伪狂犬病病毒基因工程弱毒株(b-gd&gcs株)能产生对prv野毒变异株ah02la株的完全保护，无体温反应，无临床症状，排毒率显著降低、且排毒量大幅减少、排毒时间大大缩短，而prvbarthak61株只能产生部分保护，不能阻止排毒，b-gd&gcs株作为疫苗株对变异株的保护效果显著优于barthak61株。prvb-gd&gcs株制备的活疫苗接种猪只检出prvgb抗体，未检出prvge抗体，是一种能鉴别疫苗免疫动物与野毒感染动物的diva疫苗。由于b-gd&gcs株的骨架为广泛使用的barthak61株，安全性可靠，因此是一株理想的疫苗候选弱毒株，其推广应用将非常有利于在猪场中进行prv变异株的净化，前景广阔。sequencelisting<110>江苏省农业科学院<120>伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用<130>201811091<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>1464<212>dna<213>伪狂犬病病毒ah02la株<400>1atggcctcgctcgcgcgtgcgatgctcgcgctgctggcgctctacacggcggccatcgcc60gcggcgccgtcgtccacgacggcgctcggcacgacgcccaacgggggcgggggcggcaac120agcagcgcgggcgagctctcgccctcgccgccctcgacgcccgagcccgtctcggggacg180acgggggccgcggcctccacgcccgccgccgtctcgacgccccgggtcccgccgccctcg240gtctcgcgccggaagccccagcggaacggcaacaggacgcgcgtccacggcgacaaggcc300acctcgcacgggcgcaagcgcatcgtgtgccgcgagcggctgttctcggcgagggtgggg360gacgcggtcagcttcgggtgcgccgtcgtcccgcgcgccggggagaccttcgaggtccgc420ttctgccgccgcgggcgcttccgctcgcccgacgccgaccccgagtactttgacgagccc480ccgcgcccggagctcccgcgggagcggctcctcttcagctccgccaacgcctccctcgcc540cacgcggacgcgctcgcctccgccgtcgtcgtcgagggcgagcgcgcgaccgtcgccaac600gtctcgggcgaggtgtccgtgcgcgtggccgcggcggacgccgagaccgagggcgtctac660acgtggcgcgtgctgtccgccaacggcaccgaggtccgcagcgccaacgtctcgctcgtc720ctgtaccaccagcccgagttcggcctgagcgcgccgcccgtcctcttcggcgagcccttc780cgggcggtgtgcgtcgtccgcgactactacccgcggcgcagcgtgcgcctgcgctggttc840gcggacgagcacccggtggacgccgccttcgtgaccaacagcaccgtggccgacgagctc900gggcgccgcacgcgcgtctccgtggtgaacgtgacgcgcgcggacgtcccgggcctcgcg960gccgcggacgacgcggacgcgctcgcgccgagcctgcgctgcgaggccgtgtggtaccgc1020gacagcgtggcctcgcagcgcttctccgaggccctgcgcccccacgtctaccacccggcg1080gcggtctcggtgcgcttcgtcgagggcttcgccgtctgcgacggcctctgcgtgcccccg1140gaggcgcgcctcgcctggtccgaccacgccgccgacaccgtctaccacctcggcgcctgc1200gccgagcaccccggcctgctcaacgtgcggagcgcccgcccgctgtcggacctcgacggg1260cccgtcgactacacctgccgcctcgagggcatgccctcgcagctgcccatcttcgaggac1320acgcagcgctacgacgcctcccccacgtccgtgagctggcccgtcgtgaccagcatgatc1380accgtcatcgccggcatcgccatcmtagccatcgtgctggtcatcatggcgacgtgcgtc1440tactaccgccggtccgcgctgtga1464<210>2<211>1209<212>dna<213>伪狂犬病病毒ah02la株<400>2atgctgctcgcagcgctattggcggcgctggtcgcccggacgacgctcggcgcggacgtg60gacgccgtgcccgcgccgaccttccccccgcccgcgtacccgtacaccgagtcgtggcag120ctgacgctgacgacggtcccctcgcccttcgtcggccccgcggacgtctaccacacgcgc180ccgctggaggacccgtgcggggtggtggcgctgatctccgacccgcaggtggaccggctg240ctgaacgaggcggtggcccaccggcggcccacgtaccgcgcccacgtggcctggtaccgc300atcgcggacgggtgcgcgcacctgctgtactttatcgagtacgccgactgcgaccccagg360cagatctttgggcgctgccggcgccgcaccacgccgatgtggtggaccccgtccgcggac420tacatgttccccacggaggacgagctggggctgctcatggtggccccggggcggttcaac480gagggccagtaccggcgcctggtgtccgtcgacggcgtgaacatcctcaccgacttcatg540gtggcgctccccgaggggcaagagtgcccgttcgcccgcgtggaccagcaccgcacgtac600aagttcggcgcgtgctggagcgacgacagcttcaagcggggcgtggacgtgatgcgattc660ctgacgccgttctaccagcagcccccgcaccgggaggtggtgaactactggtaccgcaag720aacggccggacgctcccgcgggcctacgccgccgccacgccgtacgccatcgaccccgcg780cggccctcggcgggctcgccgaggcccaggccccggccccggcccaggccccggccgaag840cccgagcccgccccggcgacgcccgcgccccccggccgcctgcccgagccggcgacgcgg900gaccacgccgccggggggcgccccacgccgcgacccccgaggcccgagacgccgcaccgc960cccttcgccccgccggccgtcgtgcccagcgggtggccgcagcccgcggagccgttcccg1020ccccggaccaccgccgcgccgggcgtctcgcgccaccgctcggtgatcgtcggcacgggc1080accgcgatgggcgcgctcctggtgggcgtgtgcgtctacatcttcttccgcctgaggggg1140gcgaaggggtatcgcctcctgggcggtcccgcggacgccgacgagctaaaagcgcagccc1200ggtccgtag1209当前第1页12