一种聚氨酯泡沫固定化纤维素酶酶促京尼平苷转化工艺的制作方法

本发明涉及一种聚氨酯泡沫固定化纤维素酶酶促京尼平苷转化工艺，特别涉及了一种以新型的以将单元开孔的聚氨酯泡沫作为载体，以包埋法固定化纤维素酶并转化糖苷的新工艺。

背景技术：

京尼平苷(geniposide)是栀子的主要成分之一，属于环烯醚萜苷类化合物。现代药理研究表明，京尼平苷具有抗炎、抗类风湿性关节炎、抗阿尔兹海默症、抗糖尿病及神经保护等多种药理作用。京尼平苷的水解产物京尼平具有保肝、降压、抗肿瘤等药理活性，并且常被用作天然交联剂。

纤维素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶等组成。其来源广泛，活性较高，酶促反应条件温和，是近年来被重点研究的酶类之一。纤维素酶应用范围较广，但使用效率较低，而将纤维素酶固定化，使其能够多次使用，大幅提高使用效率，故对纤维素酶固定化的研究是使纤维素酶能够更充分利用的重要途径。

聚氨酯泡沫是聚氨酯材料的主要品种之一。其中的软质泡和部分半硬质泡材料内部具有连通且交错的孔单元结构，不仅比表面积高，并且适宜孔径的孔单元能够容纳水分子通过，加之其质软、回弹性高等特点使负载于其中的纤维素酶不仅能够充分接触到水溶性的底物，还能够使酶促反应产生的产物及时排出，一定程度上减小了产物浓度对酶促反应的影响。

通过聚氨酯泡沫将纤维素酶固定在其孔单元内，使其在保证本身活性的同时，又能连续多次使用。固定化纤维素酶已被广泛应用于众多领域，尤其以医学、生物学等为主。这种方法简单温和、重复性强，并能够纤维素资源充分利用。目前，固定化纤维素酶的方法多为使纤维素酶交联于改造的复合凝胶或多孔微球等，并无关于聚氨酯泡沫直接包埋纤维素酶从而固定化纤维素酶的报道。该方法制备所得的固定化纤维素酶能够很好的保证纤维素酶原有的酶活，于此同时还能够多次重复使用，且固定化载体原材料简单易得，易于产业化生产。

技术实现要素：

为了改善纤维素酶利用率低、浪费严重等缺陷，本发明提供了一种聚氨酯泡沫固定化纤维素酶酶促京尼平苷转化工艺，在保证酶活性的情况下，增大加了固定化酶的重复使用次数，使纤维素酶对京尼平苷的转化效率得到了大幅提高。

本发明提供的一种聚氨酯泡沫固定化纤维素酶酶促京尼平苷转化工艺将纤维素酶以包埋的形式固定于聚氨酯泡沫中，其中本工艺制备的聚氨酯泡沫载体和聚氨酯泡沫固定化纤维素酶的形貌如附图1所示。

本发明提供的一种聚氨酯泡沫固定化纤维素酶酶促京尼平苷转化工艺，通过对聚氨酯泡沫载体孔单元开孔率及孔径尺寸的研究，使固定于载体中的纤维素酶能够在最大程度上接触底物京尼平苷，其中本工艺制备的聚氨酯泡沫载体和聚氨酯泡沫固定化纤维素酶的孔径分布如附图2所示。

本发明提供的一种聚氨酯泡沫固定化纤维素酶酶促京尼平苷转化工艺，在确定酶活性的情况下大幅度增加了纤维素酶的重复使用次数，其中以京尼平苷的转化率为标准，确定了该固定化酶的重复使用情况，如附图3所示。

本发明所述的一种聚氨酯泡沫固定化纤维素酶酶促京尼平苷转化工艺，其特征在于：将任何方法提取所得的纤维素酶粉末，加入适宜比例的去离子水、多元醇、表面活性剂、二月桂酸二丁基锡的聚氨酯发泡材料中混合均匀，加入一定比例的二苯基甲烷二异氰酸酯后，在20℃水浴中、转速为500r/min的机械搅拌条件下搅拌20s，然后在室温下固化24h，即可得到聚氨酯泡沫固定化纤维素酶。将制备好的固定化纤维素酶，在适宜的温度、ph的条件下，直接放置于京尼平苷水溶液中，进行酶促反应70min，取出固定化纤维素酶，高温法使溶液中的酶失活后，过滤膜并用高效液相色谱法测定生成的京尼平溶液浓度，计算京尼平苷转化率。

本发明的优点：

1.本发明选用聚氨酯泡沫作为载体，具有多孔结构，比表面积较大；机械性、稳定性好；无毒等优点，特别适合应用于固定化酶的制备。

2.本发明具有仪器设备简单、制备简便、成本低廉、易于扩大产业化等优点。

3.本发明所得固定化纤维素酶在保证原有同质量纤维素酶的活性外还能够多次重复使用，有效提高了纤维素酶对生物糖苷的使用效率。

4.本发明所得固定化纤维素酶不仅能够使负载于其中的纤维素酶充分接触到水溶性的底物，还能够使酶促反应产生的产物及时排出，一定程度上减小了产物浓度对酶促反应的影响，为用于固定化酶的载体的研究工作提供了新的思路。

附图说明

图1是聚氨酯泡沫载体(a)和聚氨酯泡沫固定化纤维素酶(b)形貌对比图；

图2是聚氨酯泡沫载体(a)和聚氨酯泡沫固定化纤维素酶的孔径分布图；

图3是聚氨酯泡沫固定化纤维素酶对京尼平苷进行酶促反应的重复使用情况曲线图。

具体实施方案

下面对本发明的实施例作进一步详细描述：将适量的粉末状纤维素酶放入适宜比例的去离子水、多元醇、表面活性剂、二月桂酸二丁基锡的聚氨酯发泡材料中混合均匀，加入一定比例的二苯基甲烷二异氰酸酯后，在20℃水浴中、转速为500r/min的机械搅拌条件下搅拌20s，然后在室温下固化24h，即得以聚氨酯泡沫为载体的固定化纤维素酶。将制备好的固定化纤维素酶，在适宜的温度、ph的条件下，直接放置于京尼平苷水溶液中，进行酶促反应70min，取出固定化纤维素酶，高温法使溶液中的酶失活后，过滤膜并用高效液相色谱法测定生成的京尼平溶液浓度，计算京尼平苷转化率。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实例1：

将质量分数为30.0％的粉末状纤维素酶放入1.3％的去离子水、37.5％的聚乙二醇400、0.5％的康道宁dc-193、0.6％的二月桂酸二丁基锡的聚氨酯发泡材料混合均匀，加入30％二苯基甲烷二异氰酸酯后，在20℃水浴中、转速为500r/min的机械搅拌条件下搅拌20s，然后在室温下固化24h，即得以聚氨酯泡沫为载体的固定化纤维素酶。将制备好的固定化纤维素酶，在35℃、ph＝6的条件下，直接放置于京尼平苷水溶液中，进行酶促反应70min，取出固定化纤维素酶，高温法使溶液中的酶失活后，过滤膜并用高效液相色谱法测定生成的京尼平溶液浓度，计算京尼平苷转化率。结果可得，经7次循环使用后，固定化纤维素酶的京尼平苷累积转化率为等质量游离纤维素酶的235.0％。

实例2：

将质量分数为27.6％的纤维素酶放入2.1％的去离子水、35.0％的聚乙二醇600、0.7％的吐温80、0.4％的二月桂酸二丁基锡的聚氨酯发泡材料中混合均匀，加入35.0％二苯基甲烷二异氰酸酯后，在20℃水浴中、转速为500r/min的机械搅拌条件下搅拌20s，然后在室温下固化24h，即得以聚氨酯泡沫为载体的固定化纤维素酶。将制备好的固定化纤维素酶，在15℃、ph＝3的条件下，直接放置于京尼平苷水溶液中，进行酶促反应70min，取出固定化纤维素酶，高温法使溶液中的酶失活后，过滤膜并用高效液相色谱法测定生成的京尼平溶液浓度，计算京尼平苷转化率。结果可得，经7次循环使用后，固定化纤维素酶的京尼平苷累积转化率为等质量游离纤维素酶的215.8％。