一种同时产五种稻曲病菌毒素的稻曲病菌的鉴定方法与流程

本发明涉及一种稻曲病菌的鉴定方法，尤其是一种同时产稻曲病菌毒素a、b、c、d和f的稻曲病菌的鉴定方法。

背景技术：

稻曲病是一种水稻真菌病害，由稻曲病菌--绿核菌属绿核菌ustilaginodeavirens(cooke)takahashi侵染水稻穗部引起。稻曲病发生较为普遍，在中国、日本、美国、印度、菲律宾等多个国家均有出现，属于世界性水稻病害。20世纪80年代前，稻曲病仅零星分布于中晚稻田，为水稻次要病害；但随着水稻品种、耕作方式、施肥用量及气候环境等因素改变，近年来，稻曲病已由过去的零星分布转变成为水稻生产中的主要病害之一。稻曲病不但在水稻穗部形成稻曲球，严重影响谷粒的生长，降低水稻的产量与品质，而且其病原真菌——稻绿核菌ustilaginodeavirens(cooke)takahashi所产生的稻曲病菌毒素对人畜具有毒害作用。目前，已逐渐引起了专家学者对稻曲病产生菌以及所产稻曲病菌毒素的广泛关注。

稻曲病菌属于一种寄生性较强腐生性较弱的真菌，稻曲球营养丰富，而且又暴露于自然环境中，常伴生大量的腐生细菌和真菌及其它病原菌，再加上稻绿核菌生长非常缓慢，故在培养的过程中极易受到其他病原菌的污染，因此，相对其他真菌来说，稻绿核菌的分离成功率很低。然而在实际的分离过程中，研究人员普遍发现采用稻曲球内层组织分离法可以成功分离到稻曲病菌，但其培养时间较长(培养5d后长出白色致密菌丝，菌丝生长较慢，约30d左右，颜色发生改变为淡黄色、黄色)，分离速度较慢，比较耗时。但该方法由于选用的是内部菌丝，杂菌较少，成功分离的机率较高。厚垣孢子悬液法，稻曲球经无菌水冲洗即可配制成厚垣孢子悬浮液，由于稻曲球表层伴有大量其他病原菌，它们的生长速度快于稻曲病菌的生长速度，极易污染稻曲病菌，而且生长速度过快的杂菌覆盖于少量馒头状的稻曲病菌单菌落上，加大分离纯化的难度。稻曲球法的缺点是多种病原菌伴生于稻曲球，在培养过程中亦可迅速生长而污染目标菌。菌核萌发法较易成功，有研究证明菌核是稻曲病菌高效分离的首选材料，但菌核形成受环境条件限制，不易收集获取菌核；而且南方稻区少见，采用此法分离南方稻曲病菌效果并不理想。孢子振落法，由于稻曲表面不作消毒处理，稻曲表面大量的杂菌易在培养基表面快速生长，影响厚垣孢子萌发、生长及菌落的纯化，同厚垣孢子悬浮液法一样易受其他病菌污染，不易成功获得稻曲病菌株。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种检测精确的同时产稻曲病菌毒素a、b、c、d和f的稻曲病菌的鉴定方法。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种同时产稻曲病菌毒素a、b、c、d和f的稻曲病菌的鉴定方法，其鉴定方法分为三部分：

第一部分，分子生物学鉴定：将纯化并处于保藏状态的菌株拿到室温状态进行菌种解冻，将解冻后的菌种接种到新鲜配制的无菌psa平板上进行活化，从psa分离平板上挑取活化后的菌株接种于ps液体培养基中，于150r/min、28℃条件中培养7天后，用离心管收集菌丝，采用真菌基因组提取试剂盒提取菌丝总dna，nanodrop2000c超微量分光光度计dna纯度后，利用真菌18s引物进行pcr扩增，pcr扩增的体系为：10×taq缓冲液5μl、10pmol的its1引物和its4引物各1μl、真菌dna提取液2μl、1utaqdna聚合酶1μl、2.5mmmgcl22μl、2mmol/ldntps3μl，无菌水补足至50μl；扩增条件为：95℃变性3min，95℃1min，59℃1min，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，再利用pcr回收试剂盒回收纯化得到目的片段，然后将扩增产物进行序列分析，返回得到测序结果，将测序结果在ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用blast软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行核算序列比对分析，根据筛选到的菌株序列与稻曲病菌属菌株序列的同源性判断筛选到的菌株是否为稻曲病菌。

第二部分，菌落形态观察：将纯化并处于保藏状态的菌株拿到室温状态进行菌种解冻，将解冻后的菌种接种到新鲜配制的无菌psa平板上进行活化，待菌种复壮成菌丝块后，用尖头挑针挑取活化平板上的小菌丝块，接种于新鲜配制的无菌psa平板上，28℃黑暗条件下培养7-14天，观察其菌落形态；

第三部分，孢子形态鉴定：将纯化并处于保藏状态的菌株拿到室温状态进行菌种解冻，将解冻后的菌种接种到新鲜配制的无菌psa平板上进行活化，活化后的菌株接种于50mlps的250ml三角瓶中，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养7-10天，得到菌丝孢子混合液，将此混合液经四层纱布过滤后所得滤液，即为薄壁分生孢子液，在400倍显微镜下观察孢子形态；

本发明的进一步设置为：所述的培养基为，(1)马铃薯蔗糖琼脂培养基(psa)：去皮马铃薯200g，加水1000ml煮沸20～30min，加热过程中注意补充水分，用八层纱布过滤，向滤液中加入20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，再加入20g蔗糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃高压湿热灭菌20分钟后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用；或(2)马铃薯蔗糖培养基(ps)：去皮马铃薯200g加水1000ml煮沸20～30min，加热过程中注意补充水分，用八层纱布过滤，滤液加蔗糖20g搅拌至完全溶解，定容至1000ml，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃高压湿热灭菌20min后取出冷却备用。

上述方法，对目标菌种有效的鉴定，确定分离方法的有效性，通过三部分鉴定，鉴定的准确性非常高。

附图说明

图1为本发明稻曲病菌菌落形态。

具体实施方式

本发明一种同时产稻曲病菌毒素a、b、c、d和f的稻曲病菌的鉴定方法，应用该方法对上述方法分离后菌株进行鉴定，

(1)菌落形态观察：将纯化后的菌株接种到新鲜配制的无菌psa平板上进行活化，用尖头挑针挑取活化平板上的小菌丝块，接种于新鲜配制的无菌psa平板上，28℃黑暗条件下培养7-14天，观察其菌落形态。

马铃薯蔗糖琼脂培养基(psa)：马铃薯200g，加水1000ml煮沸20～30min，用八层纱布过滤，加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20g蔗糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃高压湿热灭菌20分钟后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。

结果为：该菌3-5天长出小菌落，菌落白色，中央隆起，菌丝致密，边缘光滑，7-10天后菌丝呈黄色，呈典型稻曲病菌菌落特征(如图1)。

(2)孢子形态鉴定：将纯化后的菌株接种到新鲜配制的无菌psa平板上进行活化，活化后的菌株接种于50mlps的250ml三角瓶种，置于150r/min、28℃恒温摇床中培养7-10天，即得到菌丝孢子混合液。将此混合液经四层纱布过滤后所得滤液，即为薄壁分生孢子液，在400倍显微镜下观察孢子形态。

马铃薯蔗糖琼脂培养基(psa)：马铃薯200g，加水1000ml煮沸20～30min，用八层纱布过滤，加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20g蔗糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃高压湿热灭菌20分钟后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。

结果为：分生孢子均为单孢，无色透明，表明光滑，卵圆形，呈典型稻曲病菌分生孢子特征。

(3)分子鉴定：从psa分离平板上挑取纯化后的菌株接种于ps液体培养基中，于150r/min、28℃条件中培养7天后，用离心管收集菌丝，采用真菌基因组提取试剂盒提取菌丝总dna，nanodrop2000c超微量分光光度计dna纯度后，利用真菌18s引物进行pcr扩增，pcr扩增的体系为：10×taq缓冲液5μl、10pmol的its1引物和its4引物各1μl、真菌总dna提取液2μl、1utaqdna聚合酶1μl、2.5mmmgcl22μl、2mmol/ldntps3μl，无菌水补足至50μl；扩增条件为：95℃变性3min，95℃1min，59℃1min，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，再利用pcr回收试剂盒回收纯化得到目的片段，然后将扩增产物送于生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列分析，返回的测序结果提交到genbank数据库，获得相应登录号。将测序结果在ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用blast软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行核算序列比对分析。根据筛选到的菌株序列与稻曲病菌属菌株序列的同源性判断筛选到的菌株是否为稻曲病菌。

马铃薯蔗糖培养基(ps)：马铃薯200g加水1000ml煮沸20～30min，用八层纱布过滤，滤液加蔗糖20g，定容至1000ml，121℃高压湿热灭菌20min后取出冷却。

结果为：分离到的菌株编号为zzy-2，菌种提交中国典型培养物保藏中心的菌种保藏号为cctccm2016230，genbank数据库登录号为no.ku306368，同源性比对结果显示，该菌株与稻绿核菌同源性为99.9％，结合形态观察结果，确定分离到的菌株为稻曲病菌——稻绿核菌。

显然，上述实施例仅仅是为了清楚的说明所做的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围内。