番茄SAMDC1基因在培育无籽番茄中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及番茄samdc1基因在培育无籽番茄中的应用。

背景技术：

番茄是我国蔬菜产业中种植面积最大的蔬菜作物，一种自花授粉作物，具有明显的杂种优势。目前，番茄生产上主要使用杂交种子,杂交种子育种时，大多是人工去雄和授粉，但由于它们花器较小，人工去雄比较困难，而且常有自交种子的混入现象而影响杂交种子的纯度。在常规的杂交制种过程中，人工去雄需要大量的劳动力，不仅费时而且费力。

多胺是一类广泛存在于生物体内并具有强烈生物活性的低分子量的脂肪族含氮碱。高等植物体内主要有腐胺(put)、亚精胺(spd)、精胺(spm)和热精胺(tspm)等，它们以游离态、结合态和束缚态三种形态存在于组织中。大量研究表明，多胺在许多植物生长发育、花芽分化、果实发育中起着非常重要的作用。苹果花粉萌发前15分钟多胺合成速度在达到高峰；向苹果品种鲁比短枝叶柄注射多胺，可提高成花率和坐果率。研究发现，多胺可促进花粉萌发,加入多胺合成抑制剂花粉萌发受阻,若再补加put或spd,则萌发重新开始。外源spm、spd和put在低浓度时均能促进丰水梨离体花粉萌发和花粉管生长。

s-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(s-adenosyl-l-methioninedecarboxylase，samdc)是多胺代谢途径中的限速酶，主要催化s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，sam)脱羧基，形成脱羧s-腺苷甲硫氨酸(decarboxy-lateds-adenosylmethionine，dcsam)，dcsam为spd和spm的生物合成提供氨丙基。研究表明，在番茄绒毡层中同时沉默三个samdc同源基因导致雄性不育(ranjitasinhaetal.，plantmolbiol(2013)82:169-180)，但是番茄samdc家族共有5个同源基因，它们的具体功能并不清楚，并且采用基因敲除的方法敲除单个基因即能获得无籽番茄也尚未见报道。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足，本发明应用转基因技术，将番茄中的samdc1基因敲除，进而探究多胺对植物果实的影响，通过抑制多胺的合成，调控果实发育，获得无籽番茄，为samdc1基因在培育无籽番茄中的应用提供理论依据。

本发明具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供番茄samdc1基因在培育无籽番茄中的应用，所述番茄samdc1基因包含以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：

(1)如seqidno.1所示的核苷酸序列；

atggaaatggacttgccagtttctgccattggttttgaaggtttcgaaaagaggctcgaaatttctttcgtcgagcctggtctgtttgctgatcctaatggaaaaggacttcgatctctcacaaaggcacagttggatgaaattctcggacctgctgagtgcaccattgttgataacctgtcaaatgactatgttgattcctatgtgctgtccgagtcgagcctcttcgtttattcttacaagataatcatcaaaacatgtggtaccacaaagctgcttcttgcaattccgcccattctgaggttggctgagaccttgtctctcaaagtacaagacgtgaggtatacccgtgggagcttcattttccctggtgctcaatcgtttcctcaccgccacttttctgaagaagttgctgtcctcgatggatattttggaaagcttgctgccggtagcaaggctgtgattatgggaaatcccgacaaaacacagaaatggcatgtctactctgcctcagctgggactgttcagtgtaatgaccctgtttacactcttgagatgtgtatgactggtttgaacagggagaaggcatctgtcttctacaaaactgaagaaagttcggctgctcacatgactgttagatctggcatcaggaagatcctccccaagtctgagatatgtgattttgagtttgaaccctgtggttattctatgaattctattgaaggagctgctgtttcaaccattcacattaccccggaggacggctttagctatgccagctttgaatctgttggatatgatcctaaaaccaatgagttgggtcccctggttgagagggtgcttgcatgttttgagccagctgagttctctattgctctgcatgctgatgttgctaccaagttactggagcatgtttgctctgttgatgttaagggctactctcttgctgagtggagtccagaagagtttggcaaaggcggttccattgtctaccagaagttcactagaactccttactgtgaatctcccaagtccgttctgaagggctgctggaaggaggaagagaaagaaggaaaggagtag(seqidno.1)

(2)任一其碱基序列与seqidno.1所示序列有90％以上同源性且编码如seqidno.2所示氨基酸序列的dna分子。

memdlpvsaigfegfekrleisfvepglfadpngkglrsltkaqldeilgpaectivdnlsndyvdsyvlsesslfvysykiiiktcgttklllaippilrlaetlslkvqdvrytrgsfifpgaqsfphrhfseevavldgyfgklaagskavimgnpdktqkwhvysasagtvqcndpvytlemcmtglnrekasvfykteessaahmtvrsgirkilpkseicdfefepcgysmnsiegaavstihitpedgfsyasfesvgydpktnelgplvervlacfepaefsialhadvatkllehvcsvdvkgyslaewspeefgkggsivyqkftrtpycespksvlkgcwkeeekegke(seqidno.2)

本发明的第二个目的是提供一种无籽番茄的培育方法，包括如下步骤：

s1：构建含番茄samdc1基因敲除载体的根癌农杆菌工程菌a；

s2：将s1获得的根癌农杆菌工程菌a介导转化番茄外植体，制备得到samdc1基因敲除的番茄植株；

s3：将s2获得的samdc1基因敲除的番茄植株种植于温室中，培育得到无籽番茄果实。

进一步的，所述番茄samdc1基因包含以下(1)、(2)中任一所述的核苷酸序列：

(1)如seqidno.1所示的核苷酸序列；

(2)任一其碱基序列与seqidno.1所示序列有90％以上同源性且编码如seqidno.2所示氨基酸序列的dna分子。

进一步的，s1所述的番茄samdc1基因敲除是通过crispr/cas9的方式实现的。

进一步的，s1所述具体步骤为：

(1)利用http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr网站设计samdc1基因的靶序列即sgrna，所述sgrna的核苷酸序列为：gctcgactcggacagcacat(seqidno.3)，进而合成一对sgrna引物，将sgrna退火成双链；

(2)将将步骤(1)得到的退火双链插入atu6-sgrna-atubq-cas9载体bbsi酶切位点，16℃连接过夜；

(3)用hindiii和kpni双酶切atu6-sgrna-atubq-cas9载体，割胶回收大片段；连接到pcambia1301载体上，得到番茄samdc1基因的crispr/cas9载体；

(4)将步骤(3)得到的番茄samdc1基因的crispr/cas9载体转入根癌农杆菌eha105中，得到根癌农杆菌工程菌a。

进一步的，步骤(1)所述sgrna引物的核苷酸序列如下所示：

slsamdc1f：5′-gattgctcgactcggacagcacat-3′(seqidno.4)，

slsamdc1r：5′-aaacatgtgctgtccgagtcgagc-3′(seqidno.5)。

本发明的第三个目的是提供前述的无籽番茄的培育方法在培育无籽番茄中的应用。

本发明相对于现有技术实现的有益效果在于，确定了番茄samdc1基因的具体功能，经本发明研究发现，单独敲除番茄samdc1基因即可实现番茄果实出现无籽粒性状，该基因的敲除可以作为培育无籽番茄的方法，应用于无籽番茄的培育。本发明为番茄分子辅助育种提供了理论基础，操作简便，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为野生型番茄(alisacraig)无菌苗。

图2为侵染后的番茄子叶。

图3为转化后番茄愈伤组织分化形成芽。

图4为转化苗在生根培养基上分化出根系。

图5为获得的番茄果实表型图，其中图5a为野生型番茄果实，图5b为敲除samdc1基因的番茄果实。

图6为获得的番茄果实剖面图，其中图6a为野生型番茄果实，图6b为敲除samdc1基因的番茄果实。

具体实施方式

本发明通过以下详细的实施例给出。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，容许对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

本发明实施例中的引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成，序列测序由通用生物系统(安徽)有限公司完成。

实施例1番茄samdc1基因敲除载体及根癌农杆菌工程菌构建

1.番茄samdc1基因敲除载体构建

利用http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr网站设计samdc1基因的靶序列即sgrna(gctcgactcggacagcacat)，添加合适的碱基，合成两条引物(表1中的slsamdc1f和slsamdc1r)，将其退火成双链，退火的双链grna插入atu6-sgrna-atubq-cas9载体bbsi酶切位点；用hindiii和kpni双酶切atu6-sgrna-atubq-cas9载体，割胶回收大片段；连接到pcambia1301上，得到番茄samdc1敲除载体，命名为ksamdc1，由通用生物系统(安徽)有限公司测序。

表1番茄slsamdc1敲除引物序列表

2.含番茄samdc1基因敲除载体的根癌农杆菌工程菌a构建

将番茄samdc1敲除载体ksamdc1电击转入根癌农杆菌eha105中，获得含番茄samdc1基因敲除载体的根癌农杆菌工程菌a。

实施例2构建番茄samdc1基因敲除的突变体植株

1.培养无菌苗

将野生型番茄(alisacraig)种子用自来水浸泡(或用摇床28℃200r/min)6-8h，然后用75％酒精消毒30sec，之后在10％naclo中消毒15min(用摇床28℃200r/min)，灭菌蒸馏水冲洗3次并转移到灭菌器皿，接种于1/2ms培养基。25℃黑暗条件下培养至发芽，转入光照培养室，幼苗生长条件为25℃、16h光照/8h黑暗，光照强度1800lx(图1)。

2.准备外植体、培养农杆菌

种子发芽后6d，将无菌苗的子叶用刀切下，子叶带有一小段叶柄，置入看护培养基kcms中预培养1d(避光，过夜即可，看护培养时间过长容易导致侵染过度)。在含有抗生素的lb平板上挑取农杆菌单菌落，接种于20ml含有抗生素的lb中，28℃、200r/min过夜培养至对数中期(od600≈1.0，约16-24h)。先摇菌，再切子叶(12-20h之间接种)。

3.转化再生

3.1侵染

将实施例1中培养好的根癌农杆菌工程菌a菌液转到10ml离心管(封口膜封口)，4℃4000r/min离心10min；倒出培养基，加入悬浮培养基ms0.2，摇匀。将3～4皿的子叶外植体转移到倒有ms0.2的灭菌培养皿中，倒入悬浮好的菌液至od600≈0.2～0.3(7-8mlms0.2，其中2-3ml倒入培养皿)暗下接种感染4-5min，并轻轻晃动培养皿。将外植体转移到灭菌滤纸上，吸干残留的菌液，回接到kcms上，22℃共培养2d(避光)。反面朝上(图2)。

3.2选择培养、再生

共培养后，将外植体小心的转入mrs1(2z+)上，2～3周后转入mrs2(0.2z+)中培养，选择培养的过程中要及时清理污染的材料，直至长出再生芽(图3)。

4.再生芽生根、移栽

待再生芽长至1cm左右时，将芽切下(可以不切，以免伤害生根部位)，放入生根培养基中生根(图4)。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至花盆中，得番茄samdc1基因敲除植株。

实施例3构建番茄samdc1基因敲除的突变体植株

将实施例2获得的番茄samdc1基因敲除植株和野生型番茄(alisacraig)置于南京农业大学牌楼基地连栋温室内分别进行培养，待果实晚熟时采收，将果实从中间剖开，观察种子情况。结果如图5-6所示。

结果表明，相对于野生型番茄果实(图5a，图6a)，samdc1基因敲除的番茄果实变小，果脐处有突起(图5b)，内部没有种子(图6b)，证实敲除samdc1基因可以获得无籽番茄。

本发明确定了番茄samdc1基因的具体功能，经本发明研究发现，单独敲除番茄samdc1基因即可实现番茄果实出现无籽粒性状，该基因的敲除可以作为培育无籽番茄的方法，应用于无籽番茄的培育。本发明为番茄分子辅助育种提供了理论基础，操作简便，具有广泛的应用前景。

序列表

<110>南京农业大学

<120>番茄samdc1基因在培育无籽番茄中的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1083

<212>dna

<213>番茄(solanumlycopersicum)

<400>1

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<213>番茄(solanumlycopersicum)

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<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gctcgactcggacagcacat20

<210>4

<211>24

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<210>5

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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