本发明涉及动物病原快速诊断
技术领域：
：，特别是一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌lamp检测方法。
背景技术：
：：新生仔猪腹泻一直以来是危害养猪业的重要疾病，虽然引起仔猪腹泻的原因比较复杂，但致病性大肠杆菌是引起仔猪腹泻的重要病原菌。目前对大肠杆菌的检测方法主要有传统的分离鉴定、免疫血清学检测以及传统的pcr方法等，但这些方法检测步骤复杂、耗时长、灵敏度较低且对检测环境要求严格，不能满足基层现场快速准确检测的要求。环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，lamp）是notomi等发现的一种恒温核酸扩增技术，与传统的pcr技术相比，省去了pcr反应的变性、温度循环等一系列繁琐的过程，节省了反应时间，而且灵敏性比常规pcr高10倍以上。lamp技术通过4条特异性引物对目的序列的6个区域退火杂交，利用bstdna聚合酶的催化作用，在恒温条件下（60~65℃）温育30~60min，实现对目标序列的批量扩增。其反应结果可直接通过肉眼观察是否有白色焦磷酸镁沉淀产生进行判断，也可通过添加羟基萘酚蓝（hnb）、溴化乙淀(eb)、钙黄绿素或sybrgreeni等荧光染料进行显色观察。近年来，关于lamp技术的研究已经取得了较大的进展，已经在细菌检测、病毒检测、寄生虫检测、真菌和支原体检测、动物胚胎性别鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测中广泛应用。大肠杆菌的肠毒素是其在生长繁殖过程中产生和释放的一种外毒素，大肠杆菌肠毒素st2（heat-stableenterotoxintypeii，耐热肠毒素ii型）的确切作用机制尚不清楚，但可引起9周龄以下断乳小猪的肠积水，国内现已开发出了针对该毒素的多重pcr检测方法，但目前，基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌lamp检测方法尚未见报道。技术实现要素：针对现有新生仔猪源大肠杆菌检测中耗时长、灵敏度低的问题，本发明针对大肠杆菌肠毒素st2基因保守序列设计lamp引物，分别对体系中mg2+浓度、甜菜碱浓度、dntp浓度、内引物浓度、bstdna聚合酶添加量以及反应温度和反应时间等因素进行研究，最终确定各体系中各因素的浓度，建立了检测大肠杆菌肠毒素基因的lamp方法，实现新生仔猪源大肠杆菌现场快速检测。本发明是通过以下技术方案实现的：一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌lamp检测方法，其具体步骤如下：⑴病料细菌基因组模板dna的提取：取1ml细菌分离培养物于1.5ml离心管中，在冷冻离心机中，4℃，以12000rpm离心5min，弃去上清；将菌体沉淀重悬于100μl灭菌的超纯水中，用漩涡混合器混匀后；采用煮沸法分别制备各细菌的dna模板；其具体步骤如下：100℃沸水中煮沸10min，迅速将其转移至-20℃冷却5min，12000rpm离心5min后，吸取上清转移至无菌指形管中，即可作为模板，﹣20℃条件下保存备用；tsb培养基：称取tsb粉末30g，溶解于800ml蒸馏水，定容至900ml，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。⑵lamp反应体系及反应程序采用st2肠毒素基因型大肠杆菌菌液提取基因组dna作为阳性对照，超纯水作为阴性对照，以st2肠毒素基因的lamp引物进行等温扩增。反应所用特异引物见表1：表1lamp引物序列lamp反应体系为（25μl）：mg2+浓度1～2mm/l，甜菜碱0～1mm/l，bstdna聚合酶量在192u～384u/ml,dntp浓度0.4～2.4mm/l，外引物f3和b3浓度均0.2μm/l，内引物fip和bip的浓度均为0.8～2μm/l，dna模板浓度在20pg/μl～20ng/μl，余量为超纯水；反应程序为扩增温度为60℃～63℃反应45min；80℃灭活5min。⑶lamp检测反应结束后取20μl扩增产物中加入1μl1000×sybrgreeni荧光染料，充分混匀，观察颜色变化，绿色为阳性（说明样品中含大肠杆菌），橘黄色为阴性（说明样品中不含大肠杆菌）。本申请中，st2基因序列genbank登录号：m35729。本发明方法操作简单、快速便捷、灵敏度高、特异性强，为基层大肠杆菌的快速检测提供了新的技术平台。说明书附图图1为st2+大肠杆菌lamp特异性检测结果电泳图；其中，m泳道为dna分子量标准dl2000；泳道1-10依次为：阴性对照、st2+型大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、猪丹毒杆菌、变形杆菌、产气荚膜梭菌、沙门菌。图2为lamp灵敏度检测结果电泳图；其中，m泳道为dna分子量标准dl2000；1-9泳道依次为：阴性对照、500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl。图3为pcr灵敏度检测结电泳图；其中，m泳道为dna分子量标准dl2000；1-9泳道依次为：阴性对照、500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl。具体实施方式实施例中所涉及的核苷酸序列：seqidno.1(f3):gcaataaggttgaggtgatt；seqidno.2(b3):gcaaccattatttgggcg;seqidno.39(fip):tgattgtgtagatgcataggcatt-atttcttcttgcatctatgttcg；seqidno.4(bip):tagacaaatagccaaggaaagttgt-tgctccagcagtaccatc；以下实施例中涉及的沙门菌、葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、变形杆菌、链球菌、巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、产气荚膜梭菌等菌株由扬州大学成大荣教授课题组提供；st2肠毒素基因型大肠杆菌（菌种编号c83902）由中国兽医药品监察所提供；tsb培养基：称取tsb粉末30g，溶解于800ml蒸馏水，定容至900ml，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用；实施例所涉及的试剂，除非特殊说明，均为市售产品。实施例1lamp特异性检测（1）分别提取目标细菌：沙门菌、葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、变形杆菌、链球菌、巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、产气荚膜梭菌的基因组dna做模板，同时设立st2肠毒素基因型大肠杆菌的阳性对照和以超纯水为模板的阴性对照，上述目标细菌基因组模板dna的提取方法如下：分别取目标细菌接种于tsb培养基，37℃培养6～8h后，取1ml培养获得的菌液于1.5ml离心管中，在冷冻离心机中，4℃，以12000rpm离心5min，弃去上清；将菌体沉淀重悬于100μl灭菌的超纯水中，用漩涡混合器混匀后；采用煮沸法分别制备各细菌的dna模板；其具体步骤如下：100℃沸水中煮沸10min，迅速将其转移至-20℃冷却5min，12000rpm离心5min后，吸取上清转移至无菌指形管中，即可作为目标细菌基因组模板dna，﹣20℃条件下保存备用。上述以煮沸法提取目标细菌基因组模板dna的方法为本领域常规方法，具体也可参见文献:“大肠埃希菌ett2毒力岛ecs3703基因和hpi毒力岛irp2基因双重lamp检测方法的建立[j]，蔡树东等，动物医学进展,2017,38(1):1-5.”。（2）lamp反应体系及反应程序对步骤（1）获得的目标细菌基因组dna进行lamp反应，同时设立st2+肠毒素基因型大肠杆菌的阳性对照和以超纯水为模板的阴性对照，反应体系见表2：表2lamp反应体系反应程序：lamp扩增温度为60℃反应45min；80℃灭活5min。扩增结束进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（取5μl扩增产物，eb染色，100v电压下电泳40min）特异性，结果见图1，由图1结果可知，本实施例建立的lamp方法仅能扩增出相应的大肠杆菌，而对其他细菌均无交叉反应，说明本实施例建立的lamp方法具有良好的特异性。实施例2lamp和pcr灵敏性对比检测将提取的st2肠毒素基因型大肠杆菌的基因组dna模板（提取方法与实施例1相同）用超纯水按照10倍比依次稀释成500ng/μl、50ng/μl、5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、5pg/μl、500fg/μl、50fg/μl8个浓度梯度，分别取2μl不同浓度的st2肠毒素基因型大肠杆菌的基因组dna为模板，用实施例1建立的st2肠毒素基因型大肠杆菌lamp体系分别进行3次平行重复试验，同时进行常规pcr检测以比较两种检测方法的灵敏度。lamp反应体系同实施例1，lamp程序扩增温度为63℃反应45min；80℃灭活5min。prc引物及pcr反应体系如表3和表4所示：表3pcr引物序列表4pcr反应体系pcr反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s；55℃～65℃退火30s；72℃延伸30s；共30个循环；72℃延伸10min。扩增结束进行琼脂糖凝胶电泳检测，判断结果。lamp反应结束后取5μl扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察拍照，在剩余的20μl扩增产物中加入1μl1000×sybrgreeni荧光染料，充分混匀，观察颜色变化，绿色为阳性，橘黄色为阴性。检测结果如图2、图3所示，其中图2为lamp灵敏度检测结果电泳图；图3为pcr灵敏度检测结电泳图，由图2、3可知，本实施例提供的lamp方法灵敏度比常规pcr高1000倍。实施例3仔猪大肠杆菌lamp检测1、病料的采集与基因组dna提取用无菌棉拭子轻轻旋转插入腹泻仔猪肛门，沾取肛门内容物并稀释于0.8ml无菌pbs中，然后取200μl病料稀释液接种于4mltsb培养基中，37℃振摇培养6h～8h，即获得病料细菌培养物；取1ml病料细菌培养物于1.5ml离心管中，在冷冻离心机中，4℃，以12000rpm离心5min，弃去上清；将菌体沉淀重悬于100μl灭菌的超纯水中，用漩涡混合器混匀后，获得菌液；采用煮沸法制备菌体dna模板；其具体步骤如下：将菌液置于100℃沸水中煮沸10min，然后迅速转移至-20℃冷却5min，12000rpm离心5min后，吸取上清转移至无菌指形管中，即获得病料细菌基因组模板dna，﹣20℃条件下保存备用。2、临床病料的检测用提取的117份新生仔猪腹泻病料中细菌dna为模板，分别用实施例1建立的lamp方法对新生仔猪腹泻病料中大肠杆菌的菌毛进行检测，同时也采用实施案例2的常规pcr方法对病料进行检测，以验证lamp和pcr的符合率。结果发现6份样品检测到st2，采用常规pcr方法和lamp方法检测结果一致。以上实施例均为实验室检测，建议补充养殖场现地检测实施例，含样本提取、检测步骤、检测结果。以证明本方法切实可以用于现场检测。序列表<110>江苏农牧科技职业学院<120>一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌lamp检测方法<141>2018-11-12<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcaataaggttgaggtgatt20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gcaaccattatttgggcg18<210>3<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgattgtgtagatgcataggcattatttcttcttgcatctatgttcg47<210>4<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tagacaaatagccaaggaaagttgttgctccagcagtaccatc43当前第1页12当前第1页12