一株瘤胃来源的耐受丙酸盐细菌驯化方法与流程

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种耐受丙酸盐菌株的筛选、驯化及应用，所筛选和驯化的菌株gordoniaparaffinivoranszm052将联合抑菌剂丙酸盐应用于饲料发酵，主要是牧草和秸秆的有氧发酵，起到改善饲料营养价值和降解部分污染物的作用。

背景技术：

在微生物应用的领域，人们对抑菌剂的使用主要关注抑菌剂的适用范围，而针对于一种抑菌剂去获得相应的耐受菌的报道较少，从目前文献来看未见到利用丙酸盐来筛选和驯化耐受丙酸盐的细菌的相关报道，更未见到系统阐述抑菌剂与其耐受菌联合应用的报道。本技术方案旨在确立耐受丙酸盐的细菌筛选和驯化的方法，为日后系统开发耐受丙酸盐微生物，联合丙酸盐和耐受丙酸盐微生物进行应用提供技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株瘤胃来源的耐受丙酸盐细菌驯化方法，解决了现有技术中存在的无抑菌剂和耐受微生物联合应用的问题。

本发明的有益效果是通过筛选驯化得到了一株瘤胃来源的耐受丙酸盐细菌gordoniaparaffinivoranszm052，证实了该菌株在丙酸盐中有良好的生长性能；构建了耐受丙酸盐细菌的筛选和驯化方法，并提出联合使用丙酸盐和耐丙酸盐微生物进行应用的方法；观察到该菌株在羧甲基纤维素钠、碱性木质素、萘、菲、蒽、芘为碳源的培养基中均有生长，因而指明该菌株具有应用于饲料发酵，主要是牧草和秸秆的有氧发酵，起到改善饲料营养价值和降解部分污染物的作用。

本发明所采用的技术方案是：取瘤胃液，加入丙酸钠和无机盐培养基于恒温摇床，避光培养，逐渐改变丙酸钠浓度，逐次接种，完成不同浓度的丙酸钠条件下培养，将所获得的菌液在固体培养基上划线分离得到目标菌。

进一步，取5ml的瘤胃液于100ml三角瓶中，加入0.1-1％的丙酸钠和40ml的无机盐培养基于恒温摇床120-150rpm，30-39℃下避光培养，2-5天后观察菌种生长情况；逐渐改变丙酸钠浓度，逐次接种，完成不同浓度的丙酸钠条件下培养1周为1个轮次，完成3-5轮次的培养；将所获得的菌液在固体培养基上划线分离得到目标菌。

进一步，丙酸钠浓度为0.25％、0.5％、0.75％、1.0％，进行4个轮次的培养，培养条件为恒温摇床150rpm，35℃下避光培养。

进一步，无机盐培养基各种盐浓度为：mnso40.02-0.05mg/l、znso40.02-0.05mg/l、(nh4)2moo40.02-0.05mg/l、fecl30.1-0.4mg/l、cacl220-50mg/l、mgso450-80mg/l、k2hpo490-120mg/l、na2hpo4100-160mg/l、kh2po430-50mg/l、nh4cl15-50mg/l。

进一步，前期取目标菌在含有0.1-1％的丙酸钠无机盐培养基接种摇瓶培养，逐渐提高丙酸钠浓度到1％；后期使用1-5％的丙酸钠无机盐培养基摇瓶培养，其中按照葡萄糖：丙酸钠为1:20-1:5的比例加入葡萄糖，每个丙酸钠浓度培养周期为1周，逐渐提高丙酸钠的浓度到5％，将最终获得的生长旺盛的菌株进行保种。

进一步，前期丙酸钠浓度设定为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，所述后期丙酸钠浓度设定为2％、3％、4％、5％，相对应葡萄糖的浓度为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％；所述无机盐培养基各种盐浓度为：mnso40.0399mg/l、znso4·h2o0.0428mg/l、(nh4)2moo4·4h2o0.0347mg/l、fecl30.25mg/l、cacl236.4mg/l、mgso467.5mg/l、k2hpo4·h20108.75mg/l、na2hpo4·12h2o167.4mg/l、kh2po443.5mg/l、nh4cl25.0mg/l。

附图说明

图1是gordoniaparaffinivoranszm052菌株在lb培养基划线生长情况图；

图2是不同丙酸钠浓度条件下gordoniaparaffinivoranszm052菌株24小时生长后菌液的吸光度值图；

图3是不同碳源条件下gordoniaparaffinivoranszm052菌株生长情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

筛选和驯化的仪器应于121℃灭菌30min后使用，部分器皿采用干热灭菌160℃灭菌120min后使用。操作过程严格灭菌，防止杂菌污染。筛选使用无机盐培养基+瘤胃液+丙酸钠，取5ml的瘤胃液于100ml三角瓶中，加入0.1-1％的丙酸钠和40ml的无机盐培养基于恒温摇床120-150rpm，30-39℃下避光培养，2-5天后观察菌种生长情况；逐渐改变丙酸钠浓度，逐次接种，完成不同浓度的丙酸钠条件下培养1周为1个轮次，完成3-5轮次的培养；将所获得的菌液在固体培养基上划线分离得到目标菌。

丙酸钠浓度设定为0.25％、0.5％、0.75％、1.0％，进行4个轮次的培养，培养条件为恒温摇床150rpm，35℃下避光培养。本发明中所涉及的无机盐培养基各种盐浓度为：mnso40.02-0.05mg/l、znso40.02-0.05mg/l、(nh4)2moo40.02-0.05mg/l、fecl30.1-0.4mg/l、cacl220-50mg/l、mgso450-80mg/l、k2hpo490-120mg/l、na2hpo4100-160mg/l、kh2po430-50mg/l、nh4cl15-50mg/l。

优选的，驯化使用无机盐培养基+葡萄糖+丙酸钠，前期取目标菌在含有0.1-1％的丙酸钠无机盐培养基接种摇瓶培养，逐渐提高丙酸钠浓度到1％；后期使用1-5％的丙酸钠无机盐培养基摇瓶培养，其中按照葡萄糖：丙酸钠为1:20-1:5的比例加入葡萄糖，每个醋酸钠浓度培养周期为1周，逐渐提高丙酸钠的浓度到5％，将最终获得的生长旺盛的菌株进行保种。驯化前期丙酸钠浓度设定为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，驯化后期丙酸钠浓度设定为2％、3％、4％、5％，相对应葡萄糖的浓度为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％；推荐使用无机盐培养基各种盐浓度为：mnso40.0399mg/l、znso4·h2o0.0428mg/l、(nh4)2moo4·4h2o0.0347mg/l、fecl30.25mg/l、cacl236.4mg/l、mgso467.5mg/l、k2hpo4·h20108.75mg/l、na2hpo4·12h2o167.4mg/l、kh2po443.5mg/l、nh4cl25.0mg/l。

图1是gordoniaparaffinivoranszm052菌株在lb培养基划线生长情况。

图2是不同丙酸钠浓度条件下gordoniaparaffinivoranszm052菌株24小时生长后菌液的吸光度值。图2中注：由左至右依次为空白(无菌)、1号瓶(葡萄糖)、12号瓶(羧甲基纤维素钠)、13号瓶(碱性木质素)、22号瓶(萘)、23号瓶(菲)、24号瓶(蒽)、25号瓶(芘)。图3是不同碳源条件下gordoniaparaffinivoranszm052菌株生长情况。

本发明构建了耐受丙酸盐细菌的筛选和驯化方法，提出了丙酸盐和耐受丙酸盐细菌的联合应用，获取到一株瘤胃来源的耐受丙酸盐细菌gordoniaparaffinivoranszm052，证实了该菌株在丙酸盐中有良好的生长性能，同时也观察到该菌株在羧甲基纤维素钠、碱性木质素、萘、菲、蒽、芘为碳源的培养基中均有生长，因而指明该菌株具有应用于饲料发酵，主要是牧草和秸秆的有氧发酵，起到改善饲料营养价值(合成部分类胡萝卜素、降解纤维素和木质素、提供菌体蛋白、影响瘤胃微生物)和降解部分污染物(主要是多环芳烃类)的作用。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。