一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组DNA的方法与流程

本发明涉及基因提取领域，具体涉及一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组dna的方法。

背景技术：

制备基因组dna是进行基因结构和功能研究的重要步骤，在基因组dna提取过程中应尽量避免使基因组dna断裂和降解，以保障基因组dna的完整性，为下面的研究打下基础。

现有技术的提取方法主要有物理法、化学法和生物酶法。玻璃珠法：是依赖于高频率的剧烈震荡破坏细胞膜释放核酸，对核酸的完整性损伤极大，不能有效的去除红细胞，洗脱液中含有血红蛋白，影响纯度和后期实验。磁珠法：操作步骤偏多，在批量操作过程中易污染，不能有效的去除红细胞，洗脱液中含有血红蛋白，杂质含量高，纯度低，对后期的实验有影响。煮沸法：高温条件下基因组dna易降解，不能有效的去除红细胞，洗脱液中含有血红蛋白，杂质含量高于磁珠法，对后期的酶切、杂交pcr扩增抑制性强。化学法小批量单管提取：方法类似本发明可以有效的去除红细胞，得率和纯度高，但通量特别低，只适用于几个或几十个样本的操作。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组dna的方法，该方法针对性强，操作方便简洁，通量高；且硅胶柱回收基因组dna效率高、纯度高。

为了实现本发明的上述方法，所采用的技术方案是：

一种批量板式硅胶吸附柱提取血液基因组dna的方法，包括如下步骤：

血液预处理步骤：

1)转移500ul～1000ul全血样品至2.2cm96孔深孔板中，再用排枪加入700ultrx溶液；

2)用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25hz，100s；

3)震荡结束后称重配平，于板式离心机5000～6000rcf，2min，轻轻倒掉废液，吸水纸纸上倒扣放置30s(若沉淀仍显明显红色则需再进行步骤4、5，若无直接进行步骤6)；

4)再加入700ultrx溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25hz，100s；

5)于板式离心机5000～6000rcf，2min，轻轻倒掉废液，吸水纸上倒扣放置一会(若红细胞残留过多再重复一次步骤3)；

6)加入200ul1xte溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面再垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25hz，100s，结束后于板式离心机中快甩至400rcf；

基因组dna提取步骤：

1)加入200ulccf溶液和20μl蛋白酶k(proteinasek)，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧摇匀，55℃水浴锅中孵化10～40min；

2)加入300ulpr溶液和300ulba溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧充分摇匀，注意不要倒置摇晃，于板式离心机5000～6000rcf，5min；

3)转移上清液，用1000ul排枪调650ul吸取上清溶液于96孔板式柱子中(柱子套在收集板上，加ba时溶液吸最底层溶液，不要吸到蓝绿色溶液)，于板式离心机中3500rcf，1min，弃废液；

4)用排枪加入500ul漂洗液，于板式离心机5000rcf，1min，弃废液；

5)重复步骤5；

6)用排枪加入500ul80％乙醇，于板式离心机5000rcf，1min，弃废液；

7)于板式离心机5300rcf，空甩5min，以尽可能除去残留的乙醇；

8)置37℃烘箱中烘15min，以除尽残留的乙醇；

9)用排枪在柱中央悬空加入70μl洗脱液，于板式离心机5000rcf，1min；

10)用排枪在柱中央悬空加入50μl洗脱液，于板式离心机5000rcf，2min；

11)结束后电泳及测核酸浓度，然后置-20℃冰箱保存后待测。

在本发明的一个优选实施例当中，所述基因组dna提取步骤9当中，所述70μl洗脱液为加热至70℃的洗脱液，使用其进行一次洗脱，再进行所述步骤10后，可将dna得率进一步提高20-30％。

在本发明的一个优选实施例当中，所述的trx溶液为：红细胞裂解液。

在本发明的一个优选实施例当中，所述的ccf溶液为：白细胞裂解液。

在本发明的一个优选实施例当中，所述的te溶液为：tris/edta缓冲液。

在本发明的一个优选实施例当中，所述的pr溶液为：反应中和液。

在本发明的一个优选实施例当中，所述的ba溶液为：正丁醇溶液。

本发明的有益效果在于：

本方法主要用于从人或哺乳动物血液中提取基因组dna，抽提出的dna可直接用于pcr、酶切等分子生物学相关实验。本发明的方法针对性强，操作方便简洁，通量高，且硅胶柱回收基因组dna效率高、纯度高。

附图说明

图1为本方法提取的基因组dna示意图；

图2为玻璃珠法提取的基因组dna示意图；

图3为磁珠法提取的基因组dna示意图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。

血液预处理步骤：

转移500ul～1000ul全血样品至2.2cm96孔深孔板中，再用排枪加入700ultrx溶液。

用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25hz，100s。

震荡结束后称重配平，于板式离心机5000～6000rcf，2min，轻轻倒掉废液，吸水纸纸上倒扣放置30s(若红细胞残留过多再重复上述步骤)。

加入200ul1xte溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧，上面再垫一层薄的橡胶皮垫，上匀浆机：25hz，100s，结束后于板式离心机中快甩至400rcf。

提取基因组dna操作步骤：

加入200ulccf溶液和20μlproteinasek，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧摇匀，55℃水浴锅中孵化:10～40min。

注意：保温时间取决于血样的新鲜程度，新鲜的血样，55℃保温10min足以使细胞裂解，释放出基因组dna。而存放久的血样，保温则视裂解效果而定，裂解完全的血样应是透明不粘稠的液体。

加入300ulpr溶液和300ulba溶液，用96孔硅胶皮垫按对应孔号压紧充分摇匀，勿倒置摇，于板式离心机5000rcf，5min。

转移上清液，用1000ul排枪调650ul吸取上清溶液于96孔板式柱子中(柱子套在收集板上，加ba时溶液吸最底层溶液，不要吸到蓝绿色溶液)，于板式离心机中3500rcf，1min，弃废液。

用排枪加入500ul漂洗液，于板式离心机5000rcf，1min，弃废液。

重复步骤10。

用排枪加入500ul80％乙醇，于板式离心机5000rcf，1min，弃废液。

于板式离心机5300rcf，空甩5min，以尽可能除去残留的乙醇。

置37℃烘箱中烘15min，以除尽残留的乙醇。

用排枪在柱中央悬空加入70μl洗脱液，于板式离心机5000rcf，1min。

用排枪在柱中央悬空加入50μl洗脱液，于板式离心机5000rcf，2min。

结束后电泳及测核酸浓度，然后置-20℃冰箱保存。

注意：将洗脱液加热至70℃，有助于提高回收得率，再用50ul洗脱液进行第二次洗脱可以提高20％～30％的dna得率。

基因组dna检测

用分光光度计测量基因组dna含量，od260值为1相当于大约50μg/ml双链dna，当dna样品中含有蛋白质或者其他小分子污染时，会影响dna吸光值的准确测定，一般情况下同时检测同一样品的od260、od280和od230，计算其比值来衡量样品的纯度，并通过1％琼脂糖电泳凝胶判定dna的完整性，也可以判定样品中是否有rna污染(提取的dna,会有较大的rna污染，这时候做电泳可以明确看到rna的条带,而且有时候会比dna带更为明显，如果提取过程中rna降解了,那么会看到dna条带下面有一片很亮的拖带)。

参见图1-图3：

如图1所示，本方法提取的基因组dna，纯度高，无杂质。

如图2所示，玻璃珠法提取的基因组dna，有些样品研磨不充分，dna机械损伤严重。

如图3所示，磁珠法提取的基因组dna，蛋白及其他杂质含量较高。

本发明的原理在于：

以全血为基因组dna提取的材料，在全血提取基因组dna的过程中就要从有核的白细胞中提取基因组dna，因此，提取全血中的基因组dna有以下几个步骤：一、破裂红细胞，利用红细胞与白细胞膜结构的差异，用表面活性剂先使红细胞破裂，离心后收集有核的白细胞。二、释放dna，采用离子型表面活性剂使蛋白质变性细胞膜破裂释放dna，利用硅胶柱膜选择性吸附样品中基因组dna，而不吸附蛋白质和其它非核酸类物质。三、去除蛋白及杂质，采用蛋白变性溶液溶解蛋白质，经洗涤步骤，即可得到样品基因组dna。