本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种产磁小体铁氧化菌的培养方法。
背景技术：
趋磁细菌是一类能在菌体内形成纳米级磁性颗粒—磁小体，并能在外部磁场的作用下朝着磁极的一端进行运动的细菌。磁小体具有生物相容性好、粒度均一、纯度高、磁性强和晶型独特等特点，是一种极具应用潜力的天然优质磁性纳米材料资源。从趋磁细菌中提取、纯化的磁小体是单磁畴晶体，由于其具有巨大的表面积与体积比、颗粒均匀、颗粒外被一层生物膜包裹、不易发生聚集、不具细胞毒等特点，使这种纳米级的磁性颗粒在电子通讯、化工、医药卫生、生物技术等高新科技领域有着广泛的潜在应用价值，成为一种新型的有着广阔发展前景的微生物资源。
但是，现如今所应用的磁小体大多分离自magnetospirillumgryphiswaldensemsr-1和magnetospirillummagneticumamb-1，这两种趋磁细菌的培养条件极为苛刻，磁小体产量较低等缺陷极大的限制了磁小体的应用。中南大学专利“一种用于鉴定细菌趋磁性的方法”中就首次提及了嗜酸性铁氧化菌中磁小体的提取，但其更偏重于细菌趋磁性的鉴定，对磁小体提取方法及得率并未提及。本专利则对其进行了详细阐述。
而目前由于趋磁细菌对培养条件、培养基营养的质量要求和对氧分压大小的要求十分严格，对于大规模培养，如何找到性状更优良的产生磁小体的菌种并获得更有效的提取、纯化磁小体的方法，仍是难题。
技术实现要素：
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种本发明主要提供了一种产磁小体铁氧化菌的培养方法，主要解决现有铁氧化菌培养条件苛刻、磁小体产量较低等问题。本发明属于菌种培育技术领域。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种产磁小体铁氧化菌的培养方法，包括以下步骤：将产磁小体铁氧化菌接种到培养基中，发酵培养，培养温度为20-25℃。
接种时，产磁小体铁氧化菌可以为产磁小体铁氧化菌菌体或产磁小体铁氧化菌菌液。
本发明的有益效果是：采用合适的温度有利于磁小体合成，如果温度过高将导致磁小体产量降低问题，如果温度过低将到导致磁小体合成不完全，产量低的问题。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述产磁小体铁氧化菌为可以合成磁小体的嗜酸性铁氧化菌。
进一步，发酵培养过程中，通氧量为1.8-5.6l/min。
优选地，通氧量为3.6l/min。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用合适的通氧量有利于磁小体合成，如果通氧量过高将导致磁小体合成不完全问题，如果通氧量过低将到导致磁小体合成少、产量低问题。发明人在研究中意外的发现，当通氧量为3.6l/min时，产磁小体效果最好。
进一步，发酵培养的时间为25-32h。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用合适的培养时间有利于磁小体合成，如果培养时间过长将抑制磁小体合成，导致磁小体产量低的问题，如果培养时间过短将导致铁全部供应给菌体生长所需，磁小体无法合成问题。
进一步，将产磁小体铁氧化菌的菌液以体积比10％的接菌量接入培养基中。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用合适的接菌量有利于菌体生长及对培养时间的掌握，如果接菌量过多将导致菌体生长过快，到培养时间后，由于铁离子过多，将抑制磁小体合成问题，如果接菌量过少将导致菌体生长过慢，到培养时间后铁离子全部供应给菌体生长所需，磁小体无法合成问题。
进一步，按照以下比例配置培养基：硫酸铵0.24-2.4g/l，氯化钾0.1-1.0g/l，磷酸氢二钾0.5-5.0g/l，硫酸镁0.5-5.0g/l，硝酸钙0.01-0.1g/l，葡萄糖酸1.98g/l，ph值为2.0。
优选地，上述培养基的配方中，硫酸铵为0.36g/l。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述配方的培养基有利于细菌磁小体的合成，上述配方中，各组分的作用为：为菌体生长提供n源及各种菌体生长所需无机盐；各组分的用量保持在上述范围内有利于菌体生长及磁小体合成，发明人在研究中意外的发现硫酸铵为0.36g/l时，具有磁小体合成量最多的优点。合适的培养基的配方与上述的温度、通氧量、培养时间和接种量共同配合，可以有助于菌体生长并且显著提高磁小体产率，同时避免磁小体产量过低问题。
本发明还提供一种从产磁小体铁氧化菌提取磁小体的方法，包括以下步骤：
(1)采用离心的方式，收集菌体；
(2)提取磁小体：将步骤(1)收集的菌体悬浮，水浴后冰浴条件超声；将超声后的溶液置于磁铁s极静置；倾倒上清；获得磁小体。
采用上述方案的有益效果为：通过上述步骤可以从产磁小体铁氧化菌中提取磁小体。
具体的，步骤(1)对产磁小体铁氧化菌(例如：嗜酸性铁氧化菌)进行菌体收集：将生长到对数期的菌液(25-32h)用普通滤纸进行抽滤，取滤液用直径50mm、0.22μm的微孔滤膜进行二次过滤，弃滤液。取ph为2.0的硫酸将滤纸上的菌体冲下。将菌体悬浮液离心2000rpm，5min，取上清于新的ep管中，离心8000rpm，5min，弃上清。若沉淀较红，则用上述离心条件离心3次，直至沉淀不红或淡红；若沉淀不红或淡红，则用8000rpm，5min的条件反复离心4次。最后用1ml0k(0k的成分包括：硫酸铵24g/l，氯化钾1.0g/l，磷酸氢二钾5.0g/l，硫酸镁5.0g/l，硝酸钙0.1g/l加入蒸馏水溶解，采用1m硫酸调节ph值为2.0)将菌体悬浮，放入液氮罐中2-3min后冻藏于-20℃冰箱中。
采用上述方案的有益效果为：上述的参数有利于菌体细胞中的铁洗涤完全，菌体细胞不破碎，其中采用反复洗涤的操作条件有利于去除细胞中的铁，避免细胞中的铁对后面磁小体提取的影响等问题。
具体的，步骤(2)磁小体的提取，其操作步骤如下：将收集后的菌体悬浮于10mmtris-hcl缓冲溶液(ph7.4)中。于37℃水浴1h后冰浴条件超声1h。将超声后的溶液转于平底试管中，将试管底部于磁铁s极静置1h。倾倒上清。然后用1mhepes反复吹洗聚集在试管底部的磁小体颗粒。最后用10mmhepes(ph7.4)清洗磁小体8-10次，用生理盐水4℃保存。
采用上述方案的有益效果为：上述的参数有利于磁小体提取，其中采用tris-hcl和hepes缓冲溶液操作有利于细胞破碎完全和保护磁小体膜的完整性，避免磁小体膜破碎的问题。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一种培养产磁小体铁氧化菌以及提取磁小体的方法，以嗜酸性铁氧化菌为例，包括以下步骤：
(1)取实验室现有嗜酸性铁氧化菌，对其进行发酵培养：取嗜酸性铁氧化菌菌液，按10％(v/v)的接菌量(菌液中菌体浓度为5mg/l)接入盛有培养基的发酵罐中，培养温度为20-25℃，通氧量为1.8-5.6l/min，培养时间为25-32h，培养基为(以1l计)：硫酸铵0.24-2.4g，氯化钾0.1-1.0g，磷酸氢二钾0.5-5.0g，硫酸镁0.5-5.0g，硝酸钙0.01-0.1g，葡萄糖酸为1.98g，加蒸馏水至1000ml，使用1.0m硫酸调节ph值为2.0。此温度、通氧量及培养基更有助于菌体生长及磁小体合成。
(2)对嗜酸性铁氧化菌进行菌体收集：将生长到对数期的菌液(培养时间为25-32h)用普通滤纸进行抽滤，取滤液用直径50mm、0.22μm的微孔滤膜进行二次过滤，弃滤液。取ph为2.0的硫酸将滤纸上的菌体冲下。将菌体悬浮液离心2000rpm，5min，取上清于新的ep管中，离心8000rpm，5min，弃上清。若沉淀较红，则用上述离心条件离心3次，直至沉淀不红或淡红；若沉淀不红或淡红，则用8000rpm，5min的条件反复离心4次。最后用1ml0k(硫酸铵24g/l，氯化钾1.0g/l，磷酸氢二钾5.0g/l，硫酸镁5.0g/l，硝酸钙0.1g/l加入蒸馏水溶解，采用1m硫酸调节ph值为2.0)将菌体悬浮，放入液氮罐中2-3min后冻藏于-20℃冰箱中。
(3)磁小体的提取，其操作步骤如下：将收集后的菌体悬浮于10mmtris-hcl缓冲溶液(ph7.4)中。于37℃水浴1h后冰浴条件超声1h。将超声后的溶液转于平底试管中，将试管底部于磁铁s极静置1h。倾倒上清。然后用1mhepes反复吹洗聚集在试管底部的磁小体颗粒。最后用10mmhepes(ph7.4)清洗磁小体8-10次，用生理盐水4℃保存。
实施例1：
(1)嗜酸性铁氧化菌的发酵培养：取嗜酸性铁氧化菌菌液(菌液中菌体浓度为5mg/l)，按菌液与培养基体积比为10％的接菌量接入发酵罐中，培养温度为20℃，通氧量为1.8l/min，培养时间28h，培养基(以1l计)：硫酸铵0.24g，氯化钾0.1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硝酸钙0.01g，葡萄糖酸为1.98g，加蒸馏水至1000ml，使用1.0mh2so4调节ph值为2.0。
(2)对嗜酸性铁氧化菌进行菌体收集：将生长好的菌液(对数期)用普通滤纸进行抽滤，取滤液用直径50mm、0.22μm的微孔滤膜进行二次过滤，弃滤液。取ph为2.0的硫酸将滤纸上的菌体冲下。将菌体悬浮液离心2000rpm，5min，取上清于新的ep管中，离心8000rpm，5min，弃上清。若沉淀较红，则用上述离心条件离心3次，直至沉淀不红或淡红；若沉淀不红或淡红，则用8000rpm，5min的条件反复离心4次。最后用1ml0k将菌体悬浮，放入液氮罐中2-3min后冻藏于-20℃冰箱中。
(3)磁小体的提取，其操作步骤如下：将收集后的菌体悬浮于10mmtris-hcl缓冲溶液(ph7.4)中。于37℃水浴1h后冰浴条件超声1h。将超声后的溶液转于平底试管中，将试管底部于磁铁s极静置1h。倾倒上清。然后用1mhepes反复吹洗聚集在试管底部的磁小体颗粒。最后用10mmhepes(ph7.4)清洗磁小体8-10次，用生理盐水4℃保存。
(4)最后得到磁小体产率(即每升菌液产生的磁小体的克数)为0.2122mg/l，菌体得率为0.0322g/l。
实施例2：
(1)嗜酸性铁氧化菌的发酵培养：取嗜酸性铁氧化菌菌液(菌体浓度为5mg/l)，按菌液与培养基体积比为10％的接菌量接入发酵罐中，培养温度为30℃，通氧量为3.6l/min，培养时间为28h，培养基(以1l计)：硫酸铵1.2g，氯化钾1.0g，磷酸氢二钾5.0g，硫酸镁5.0g，硝酸钙0.1g，葡萄糖酸为1.98g，加蒸馏水至1000ml，使用1m硫酸调节ph值为2.0。
(2)对嗜酸性铁氧化菌进行菌体收集：将生长好的菌液(对数期)用普通滤纸进行抽滤，取滤液用直径50mm、0.22μm的微孔滤膜进行二次过滤，弃滤液。取ph为2.0的硫酸将滤纸上的菌体冲下。将菌体悬浮液离心2000rpm，5min，取上清于新的ep管中，离心8000rpm，5min，弃上清。若沉淀较红，则用上述离心条件离心3次，直至沉淀不红或淡红；若沉淀不红或淡红，则用8000rpm，5min的条件反复离心4次。最后用1ml0k将菌体悬浮，放入液氮罐中2-3min后冻藏于-20℃冰箱中。
(3)磁小体的提取，其操作步骤如下：将收集后的菌体悬浮于10mmtris-hcl缓冲溶液(ph7.4)中。于37℃水浴1h后冰浴条件超声1h。将超声后的溶液转于平底试管中，将试管底部于磁铁s极静置1h。倾倒上清。然后用1mhepes反复吹洗聚集在试管底部的磁小体颗粒。最后用10mmhepes(ph7.4)清洗磁小体8-10次，用生理盐水4℃保存。
(4)最后得到磁小体产率为0.3234mg/l，菌体得率为0.0365g/l。
实施例3：
(1)嗜酸性铁氧化菌的发酵培养：取嗜酸性铁氧化菌菌液(菌液中菌体浓度为5mg/l)，按菌液与培养基体积比为10％的接菌量接入发酵罐中，培养温度25℃，通氧量5.6l/min，培养时间30h，培养基(以1l计)：硫酸铵0.36g，氯化钾0.1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硝酸钙0.01g，葡萄糖酸为1.98g，加蒸馏水至1000ml，使用1m硫酸调节ph值为2.0。
(2)对嗜酸性铁氧化菌进行菌体收集：将生长好的菌液(对数期)用普通滤纸进行抽滤，取滤液用直径50mm、0.22μm的微孔滤膜进行二次过滤，弃滤液。取ph为2.0的硫酸将滤纸上的菌体冲下。将菌体悬浮液离心2000rpm，5min，取上清于新的ep管中，离心8000rpm，5min，弃上清。若沉淀较红，则用上述离心条件离心3次，直至沉淀不红或淡红；若沉淀不红或淡红，则用8000rpm，5min的条件反复离心4次。最后用1ml0k将菌体悬浮，放入液氮罐中2-3min后冻藏于-20℃冰箱中。
(3)磁小体的提取，其操作步骤如下：将收集后的菌体悬浮于10mmtris-hcl缓冲溶液(ph7.4)中。于37℃水浴1h后冰浴条件超声1h。将超声后的溶液转于平底试管中，将试管底部于磁铁s极静置1h。倾倒上清。然后用1mhepes反复吹洗聚集在试管底部的磁小体颗粒。最后用10mmhepes(ph7.4)清洗磁小体8-10次，用生理盐水4℃保存。
(4)最后磁小体产率为0.4327mg/l，菌体得率为0.0321g/l。
实施例4：
从含铁量高的菌种中获得的嗜酸性铁氧化菌，对其进行发酵培养：取嗜酸性铁氧化菌菌液(菌液中菌体浓度为5mg/l)，按菌液与培养基体积比为10％的接菌量接入发酵罐中，培养温度为25℃，通氧量为5.6l/min，培养时间为25h，培养基为(以1l计)：硫酸铵2.4g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾2.5g，硫酸镁2.5g，硝酸钙0.5g，葡萄糖酸为1.98g，加蒸馏水至1000ml，使用1.0m硫酸调节ph值为2.0。此温度、通氧量及培养基更有助于菌体生长及磁小体合成。
其余步骤均与实施例3相同。
最后磁小体产率为0.2143mg/l。菌体得率为0.0533g/l。
实施例5：
在实施例3的基础上，将培养时间调整为32h，其余均与实施例3相同。
最后磁小体产率为0.2712mg/l。菌体得率为0.0418g/l。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。