一种鸡球虫卵囊的培养和保存液及其应用的制作方法

本发明属于兽医寄生虫学领域,具体涉及一种鸡球虫卵囊的培养和保存液。

背景技术：

鸡球虫为肠道寄生原虫，鸡球虫卵囊随粪便排出动物体内，粪便中同时含有大量肠道细菌和微生物，且新鲜排出的鸡球虫卵囊为未孢子化卵囊，不具感染性，需在适宜的温度、氧气、湿度条件下经一定时间完成孢子化生殖，形成孢子化卵囊。因此，鸡球虫卵囊培养和保存液首选具有消毒抑菌作用的物质抑杀其它微生物，同时对鸡球虫卵囊的孢子化和活力不产生影响。

重铬酸钾溶液具有较强的杀菌作用，是国内外一直以来最常用的鸡球虫卵囊培养和保存液，使用浓度一般为2-2.5%（质量体积比），但重铬酸钾具有强刺激性，对人与动物的健康、环境卫生等会造成一定影响。目前在鸡球虫病活卵囊疫苗中使用的培养和保存液还有氯胺类物质，如氯胺b和氯胺t。氯胺是一种氯—氨混合物，具有氧化和消毒的作用，但不稳定，消毒能力比较弱，杀菌作用不及自由氯。因此，亟待寻找一种新的安全高效、性质稳定的球虫卵囊培养保存液替代现有球虫卵囊培养和保存液，以降低球虫卵囊培养和保存液对人体健康和环境卫生的影响，同时还能提高球虫卵囊存活时间。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鸡球虫卵囊培养和保存液，以解决现有培养和保存液存在对人与动物的健康、环境卫生造成一定影响的问题。

本发明的另一个目的是提供一种其在鸡球虫卵囊培养及保存中的应用。

为了达到所述的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种鸡球虫卵囊的培养和保存液，其为质量浓度是0.1～10%的山梨酸钾水溶液。

做为本发明的进一步改进，其为质量浓度是1~3%的山梨酸钾水溶液。

上述的一种鸡球虫卵囊的培养和保存液在鸡球虫卵囊培养和保存中的应用。

本发明中的鸡球虫卵囊培养和保存液为山梨酸钾。山梨酸钾为无色至白色鳞片状结晶或结晶性粉末，无臭或稍有臭味，英文名：potassiumsorbate，分子式为c6h7ko2，分子量为150.22。山梨酸钾以碳酸钾或氢氧化钾和山梨酸为原料制得，在空气中不稳定，能被氧化着色，有吸湿性，易溶于水、乙醇。

本发明的益处在于：山梨酸钾作为一种较为安全、高效的防腐剂，易溶于水，使用方便，能有效抑制细菌生长，对卵囊孢子化率不产生影响，并可显著提高保存的鸡球虫卵囊活力，如应用至鸡球虫病活疫苗中，将延长疫苗保存期，大幅降低疫苗生产成本。

本发明以山梨酸钾溶液作为球虫卵囊培养和保存液。试验结果显示，山梨酸钾溶液具有明显抑菌作用且对卵囊孢子化率不产生影响，鸡球虫卵囊在1-3%山梨酸钾溶液（质量体积比）中保存于4℃，保存3、6、9、12个月时，维持的卵囊活力显著高于在2.5%重铬酸钾中保存的卵囊活力。试验结果表明，山梨酸钾溶液能显著提高长时间保存的卵囊活力，如应用至鸡球虫病活疫苗，将延长疫苗保存期。

本发明产品安全高效、性质稳定的球虫卵囊培养保存液替代现有球虫卵囊培养和保存液，以降低球虫卵囊培养和保存液对人体健康和环境卫生的影响，同时还能提高球虫卵囊存活时间。

附图说明

图1是鸡球虫卵囊在不同浓度山梨酸钾溶液中的孢子化率图。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明中，鸡球虫卵囊、山梨酸钾水溶液的用量并未给出特别限定，可以根据具体应用需求进行调整。

实施例1

新鲜的柔嫩艾美耳球虫卵囊保存于山梨酸钾的水溶液中，其中山梨酸钾溶液的质量体积比浓度为0.1%。

实施例2

新鲜的柔嫩艾美耳球虫卵囊保存于山梨酸钾的水溶液中，其中山梨酸钾溶液的质量体积比浓度为0.5%。

实施例3

新鲜的柔嫩艾美耳球虫卵囊保存于山梨酸钾的水溶液中，其中山梨酸钾溶液的质量体积比浓度为1%。

实施例4

新鲜的柔嫩艾美耳球虫卵囊保存于山梨酸钾的水溶液中，其中山梨酸钾溶液的质量体积比浓度为3%。

实施例5

新鲜的柔嫩艾美耳球虫卵囊保存于山梨酸钾的水溶液中，其中山梨酸钾溶液的质量体积比浓度为5%。

实施例6

新鲜的柔嫩艾美耳球虫卵囊保存于山梨酸钾的水溶液中，其中山梨酸钾溶液的质量体积比浓度为10%。

鸡球虫卵囊

柔嫩艾美耳球虫yl株，来源于广西玉林的鸡粪中。

试验动物和饲料

1日龄黄羽肉鸡，购自于广东智威农业科技股份有限公司，饲养于无鸡球虫污染笼舍内，按肉鸡饲养标准（鸡饲养标准ny/t33-2004）饲养。

饲料为不含任何抗球虫药物肉小鸡全价料，购自兰州养动力饲料有限公司。

主要试剂

纯水；

山梨酸钾（化学纯cp，购自北京索莱宝科技有限公司）；

重铬酸钾（化学纯cp，购自国药集团化学试剂有限公司）。

山梨酸钾溶液配制：分别称取0.1、0.5、1、3、5、10g山梨酸钾，加纯水定容至100ml，常温下溶解（期间可多次搅拌或过夜溶解）。

重铬酸钾溶液配制：称取2.5g重铬酸钾，加纯水定容至100ml，常温下溶解（期间可多次搅拌或过夜溶解）。

《不同浓度山梨酸钾溶液对鸡球虫卵囊孢子化的影响》

5只14日龄无球虫感染黄羽雏鸡，每只鸡分别经口接种柔嫩艾美耳球虫yl株孢子化卵囊5×10⁴个。接种后168h，剖杀所有鸡只，收集双侧盲肠，纵向剪开，刮取肠道内容物和粘膜层，刮取物加入至200ml15%次氯酸钠溶液中（v/v），充分搅拌混匀后室温静置10min后，依次经100目和200目不锈钢筛过滤，收集滤液，滤液中含新鲜的柔嫩艾美耳球虫卵囊。

准备8根洁净的50ml离心管，编号分别为1-8，各管分别加入20ml卵囊滤液，离心（3000rpm，10min），弃上清。1号离心管的卵囊沉淀用40ml纯水重悬，2号离心管的卵囊沉淀用40ml2.5%重铬酸钾溶液重悬，3-8号管分别用40ml0.1%、0.5%、1%、3%、5%、10%的山梨酸钾溶液重悬。各管重悬后的卵囊液移入至另一洁净的250ml锥形瓶中，锡箔纸封口后于28℃恒温培养箱振荡（120rpm）培养。

培养48h后，用血细胞计数板对未处理组和各试验组卵囊进行未孢子化卵囊量和孢子化卵囊量计数，并计算孢子化率。

孢子化率计算公式为：

孢子化卵囊总量/（孢子化卵囊总量+未孢子化卵囊总量）×100%。

孢子化结束后，各取适量卵囊培养液涂布营养肉汤琼脂平板，于37℃恒温培养箱中培养24-72h，观察细菌生长情况。

各组孢子化率计算结果显示，各组孢子化率均超过80%，且差异不显著（(p＞0.05，图1）。其中，纯水和2.5%重铬酸钾中柔嫩艾美耳球虫卵囊的孢子化率分别为83.18±0.6%和84.49±0.6%；0.1%、0.5%、1%、3%、5%、10%的山梨酸钾溶液中柔嫩艾美耳球虫卵囊的孢子化率分别为82.27±1.9%、83.65±0.8%、86.01±0.7%、85.83±0.4%、84.87±1.4%、84.57±0.6%。

细菌观察结果显示，除纯水对照组和0.1%山梨酸钾试验组出现菌落外，其余各组均未见菌落形成，说明0.5%-10%山梨酸钾溶液能有效抑制鸡球虫卵囊培养液中细菌的生长。

《长期保存对鸡球虫卵囊活力的影响》

以0.1%、0.5%、1%、3%、5%、10%的山梨酸钾溶液保存的柔嫩艾美耳球虫玉林株孢子化卵囊于4℃条件下保存，分别于保存3、6、9、12个月时，各浓度组均以3×10⁴个孢子化卵囊的感染量经口接种感染10只14日龄无球虫感染鸡只，同时以相同剂量的在2.5%重铬酸钾溶液中保存相同时间的孢子化卵囊为感染对照组。接种后观察各组鸡只临床症状和血便情况，接种后第7天，扑杀各组存活鸡只并收集各组鸡只的盲肠，纵向剪开盲肠后，刮取盲肠内容物及粘膜上皮组织，各组刮取物分别加入至200ml15%次氯酸钠溶液中（v/v），充分搅拌混匀后室温静置10min后，用血细胞计数板对各组卵囊量进行计数。

性状观察结果显示，4℃条件下，纯水长时间保存鸡球虫卵囊，卵囊液中出现大量黑色成团絮状沉淀，表明污染严重，因此，不能直接用纯水长时间保存鸡球虫卵囊。在添加不同浓度山梨酸钾或重铬酸钾后，各组卵囊液较为均匀，底物有少量沉淀（沉淀为卵囊）。卵囊活力测定结果显示，低浓度山梨酸钾溶液在维持卵囊活力能力低于2.5%重铬酸钾溶液；鸡球虫卵囊在1%-3%山梨酸钾溶液中保存，保持的卵囊活力显著高于保存于2.5%重铬酸钾溶液中的卵囊；随着浓度的升高，维持鸡球虫卵囊活力能力降低（结果如表1：不同浓度山梨酸钾溶液长时间保存的卵囊活力测定结果）。试验结果表明，1%-3%山梨酸钾溶液能显著提高鸡球虫卵囊活力，可替代重铬酸钾作为鸡球虫卵囊的培养和保存液，如应用至鸡球虫病活疫苗，将显著提高疫苗保存期，降低生产成本。