本发明涉及分离纯化技术领域，更具体地，涉及一种提取n-乙酰神经氨酸的方法。
背景技术：
唾液酸又称燕窝酸，是一类神经氨酸的衍生物。在大部分哺乳动物组织中发现的唾液酸主要是n-乙酰神经氨酸，所以通常把n-乙酰神经氨酸称为唾液酸。哺乳动物体内普遍存在唾液酸，相对而言在脑脊液和粘液中最多，婴儿在幼年期唾液酸含量较高，对其身体发育具有重要意义。
唾液酸的生产方法主要以发酵法、酶合成法、天然产物提取法为主。在现有技术中，有公开一种连续分离唾液酸的方法，该方法将发酵液经过过滤、超滤、过离子交换树脂吸附，再经过去离子水洗杂、氯化钠溶液进行洗脱、氢氧化钠溶液进行树脂再生，收集洗脱液用乙醇水浸泡后再加入乙酸乙酯结晶，收集晶体干燥，得到产品。该方法的缺点有：所用化学试剂较多，产生的废水较多，较难处理；如：用氢氧化钠溶液去再生树脂，会产生大量碱液，需要用酸中和后，再进行废水处理；树脂吸附能力有限，再生过程操作复杂，再生后吸附效果不好；收集的洗脱液，需要用乙醇水、乙酸乙酯混合结晶，晶体结晶过程会包裹乙酸乙酯、乙醇、水，干燥后依然会残留少量上述溶剂；结晶后的乙醇水、乙酸乙酯溶剂混合物杂质较多，会产生废水，需要另外投入精力处理。
另外一种对微生物发酵法生产的n-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，是将产n-乙酰神经氨酸大肠杆菌发酵液，通过除菌、除蛋白、脱色、除盐、结晶，获得高纯n-乙酰神经氨酸。该方法的缺点有：在处理菌体时需要加入发酵液量的10-20％的蒙脱石粉絮凝剂，来前处理菌体，其中，改絮凝剂使用量较大，有很能会带入到产品中；在结晶中，会使用大量的乙酸结晶，晶体结晶会包裹乙酸，且乙酸在真空干燥条件下较难除干净，最终的产品会含有乙酸残溶。
大部分sa纯化提取的工艺会在除蛋白、洗脱等步骤使用乙醇。而乙醇在生产运输过程中会接触到大量塑料制品，并溶出塑化剂，而塑化剂被证实会干扰人体内分泌，影响生殖系统，长期使用对心血管、肝脏、泌尿系统都有较大伤害，为健康带来风险，在食品安全上有严格的限制，尤其是唾液酸的产品受众群大部分为孕妇和婴幼儿，更需要关注sa终产品的塑化剂问题。
现有的sa结晶技术通常用乙酸乙酯、乙酸结晶，而结晶后的晶体中往往会包裹这些溶剂，并且在干燥的条件下也难以除净，无论哪一种晶型都含有少量的乙醇、乙酸或乙酸乙酯或dmso。含有溶残的产品不仅会给产品感官带来气味上的不悦，给产品的应用也带来麻烦，在食品安全上也造成隐患。并且如果用乙酸结晶，溶剂的用量较大，通常是产品的5-7倍，不利于工业化生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，该方法包括如下步骤：
将ph为5～7含有唾液酸的溶液使用硫酸或高氯酸将ph调至0.5～2，结晶，收集粗晶体，洗涤干燥即得；所述含有唾液酸的溶液中唾液酸的含量为200～600g/l，优选的含量为300～600g/l。
本发明使用硫酸或高氯酸将含有特定含量的唾液酸的溶液进行结晶，可以得到纯度较高的n-乙酰神经氨酸，且整个过程中无溶剂塑化剂的残留。
其中，硫酸为98％浓硫酸配置的，高氯酸为70％浓度得高氯酸配置，浓度优选30～40％。若未特别指明，在本发明实施例中均以该浓度的范围的硫酸或高氯酸为例。
在本发明一个优选实施方式中，所述含有唾液酸的溶液由含唾液酸发酵液制得。其中，所述含有唾液酸的溶液的制备方法优选包括如下步骤：将含唾液酸发酵液除去菌体和杂蛋白后，再将ph调至5～7即得。在本发明中，最优选地是使用由含唾液酸发酵液制得含有唾液酸的溶液。
在本发明一个优选实施方式中，所述含有唾液酸的溶液由聚唾液酸发酵液制得。其中，所述含有唾液酸的溶液的制备方法优选包括如下步骤：将聚唾液酸发酵液除去菌体和杂蛋白后得到电导率小于2000μs/cm的溶液，使用酸性物质如盐酸、硫酸或者其他酸将所述溶液的ph调至1～2，80℃下水解3～4h，过滤，将滤液的ph调至5～7即得。
在本发明一个优选实施方式中，所述含有唾液酸的溶液由燕窝水溶液制得。其中，所述含有唾液酸的溶液的制备方法优选包括如下步骤：将燕窝水溶液ph调至1～2，80℃下水解3～4h，活性炭吸附，将清液的ph调至5～7即得。
使用上述步骤得到含有唾液酸的溶液，若是得到的溶液中唾液酸的浓度小于200g/l，可以使用浓缩等手段将该溶液中的唾液酸的浓度设在200～600g/l之间，优选采用蒸发手段进行浓缩。
在本发明一个优选实施方式中，在结晶之前还可以采用超滤和/或纳滤的步骤，过滤杂质、小分子盐，进一步提高纯度。
在本发明一个优选实施方式中，含有唾液酸的溶液的ph优选为5～7。当含有唾液酸的溶液是由唾液酸发酵液、聚唾液酸发酵液或是燕窝水溶液制得时，即可以在优选处理步骤的最后将滤液或是清液的ph调至5～6即可，此步骤主要是目的是防止溶液长时间处于酸性环境导致唾液酸单体的降解，更重要的是能够使唾液酸浓缩浓度达到200-600g/l之间，提高唾液酸收率。
在本发明一个优选实施方式中，结晶的温度为0～4℃，结晶的时间为4～24h。其中，在结晶时，含有唾液酸的溶液的ph为0.5～2。即更优选地是，将ph为5～7含有唾液酸的溶液使用硫酸将ph调至1～2，在2～4℃下结晶16～20h。
在本发明一个优选实施方式中，使用离心或板框过滤收集粗晶体。为了进一步减少产物的杂质，提高纯度，减少产物中所含水分，优选使用离心收集粗晶体。所述离心的速度优选为4000～10000rpm，离心的时间为10～60min。进一步优选地是，所述离心的速度为9000～10000rpm，离心的时间为10～15min。
在本发明一个优选实施方式中，使用水在0～10℃下洗涤。洗涤具体可以优选为：在0～10℃下，向所述粗晶体中加入粗晶体重量25％～50％的水，洗涤1～2次。所述洗涤具体为搅拌10～30min后再离心10～60min。其中，离心速度的速度优选为4000～10000rpm。其中，更优选地是，搅拌30min后再以9000～10000rpm离心10～15min。
在本发明一个优选实施方式中，本发明提取n-乙酰神经氨酸的方法包括如下步骤：
将ph为5～7含有唾液酸的溶液使用硫酸或高氯酸将ph调至0.5～2，在0～4℃下结晶4～24h，离心收集粗晶体，使用纯水洗涤干燥即得n-乙酰神经氨酸；所述含有唾液酸的溶液中唾液酸的含量为200～600g/l。
本发明另一目的在于提供由上述方法提取得到的n-乙酰神经氨酸。
本发明另一目的在于提供一种从含有唾液酸溶液中提取得到的n-乙酰神经氨酸，所述n-乙酰神经氨酸的纯度≥98％，所述n-乙酰神经氨酸中溶剂残留为0，塑化剂含量为0。
本发明的方法使用无机溶剂，操作简单，无环境污染，得到的n-乙酰神经氨酸产品无溶残，无塑化剂残留，纯度≥98％，产品收率高达76％，所述n-乙酰神经氨酸中溶剂残留为0，塑化剂含量为0，安全度高。
本发明的方法使用无机溶剂，操作简单，无环境污染，得到的n-乙酰神经氨酸产品无溶残，无塑化剂残留，纯度≥98％，产品收率高达80％，安全度高。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
本实施例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：
1)将聚唾液酸发酵液经过陶瓷膜过滤除菌体，将清液加热到70℃，使清液重的蛋白变性析出，加热半小时后，加活性炭脱色并吸附蛋白，加活性炭搅拌半小时，过滤并降温到室温，得到电导率为小于2000μs/cm的溶液，得到聚唾液酸；
2)向步骤1)得到的聚唾液酸中加入硫酸使ph＝1，80℃水解4小时，得到唾液酸；
3)使用超滤膜1kda除去未水解完全的聚唾液酸，得到sa清液；
4)向步骤3)得到的sa清液中加入氢氧化钠，ph调节至6；
5)将步骤4)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热蒸发浓缩以使所述纳滤液中sa含量为450g/l；
6)将步骤5)得到的溶液使用硫酸将ph调至1后，降温到2℃搅拌16小时，结晶。
7)采用转速为10000的离心机过滤机收集粗晶体，加粗晶体量25％去离子纯水，在0℃下进行洗涤1次，洗涤方式为搅拌30min，离心10min；洗涤后干燥即得，干燥后的晶体经液相检测含量为98.6％，晶体收率为70％，气相检测溶剂残留为0，液相检测塑化剂含量为0。
实施例2
本实施例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：
1)将唾液酸发酵液经过陶瓷膜过滤除菌体，将清液加热到80℃，使清液中的蛋白变性析出，加热半小时后，加活性炭脱色并吸附蛋白，加活性炭搅拌半小时，过滤并降温到室温，得到唾液酸清液(sa清液)；
2)向步骤1)得到的sa清液中加入氢氧化钠ph调节至6；
3)将步骤2)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热蒸发浓缩，以使所述纳滤液中sa含量480g/l；
4)将步骤3)得到的溶液使用高氯酸将ph调至1后，降温到2℃搅拌20小时，结晶。
5)采用转速为10000的离心机收集粗晶体，加粗晶体量25％去离子纯水，在0℃下进行洗涤1次，洗涤方式为搅拌30min，离心10min；洗涤后干燥即得。干燥后的晶体经液相检测含量为99.5％，晶体收率为72％，气相检测溶剂残留为0，液相检测塑化剂含量为0。
实施例3
本实施例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：
1)将燕窝水溶液ph调至1.5，80℃下水解4h，在80℃下加入活性炭反应30min，过滤，得到含有唾液酸的溶液；
2)向步骤1)得到的sa清液中加入氨水碱ph调节至6；
3)将步骤2)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热以使所述纳滤液中sa含量450g/l；
4)将步骤3)得到的溶液使用硫酸将ph调至2后，降温到0℃搅拌8小时，结晶。
5)采用转速为9000的离心机收集粗晶体，加粗晶体量25％去离子纯水，在0℃下进行洗涤2次，洗涤方式为搅拌30min，离心15min；洗涤后干燥即得。干燥后的晶体经液相检测含量为98.7％，晶体收率为70％，气相检测溶剂残留含量为0，乙醇含量为0，液相检测塑化剂含量为0。
实施例4
本实施例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，其提取方法与实施例2中相同，不同仅在于：
2)向步骤1)得到的sa清液中加入氢氧化钠ph调节至5；
3)将步骤2)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热蒸发浓缩，以使所述纳滤液中sa含量300g/l；
4)将步骤3)得到的溶液使用高氯酸将ph调至2后，降温到4℃搅拌20小时，结晶。
5)采用转速为9000的离心机收集粗晶体，加粗晶体量50％去离子纯水，在4℃下进行洗涤1次，洗涤方式为搅拌30min，离心15min；洗涤后干燥即得。干燥后的晶体经液相检测含量为98.8％，晶体收率为71％，气相检测溶剂残留为0，液相检测塑化剂含量为0。
实施例5
本实施例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，其提取方法与实施例2中相同，不同仅在于：
2)向步骤1)得到的sa清液中加入氢氧化钠ph调节至8；
3)将步骤2)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热蒸发浓缩，以使所述纳滤液中sa含量500g/l；
4)将步骤3)得到的溶液使用硫酸将ph调至2后，降温到0℃搅拌24小时，结晶。
5)采用转速为10000的离心机收集粗晶体，加粗晶体量50％去离子纯水，在2℃下进行洗涤1次，洗涤方式为搅拌10min，离心10min；洗涤后干燥即得。干燥后的晶体经液相检测含量为98.9％，晶体收率为71％，气相检测溶剂残留为0，液相检测塑化剂含量为0。
实施例6
本实施例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，其提取方法与实施例2中相同，不同仅在于：
2)向步骤1)得到的sa清液中加入氢氧化钠ph调节至5；
3)将步骤2)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热蒸发浓缩，以使所述纳滤液中sa含量200g/l；
4)将步骤3)得到的溶液使用硫酸将ph调至0.5后，降温到4℃搅拌4小时，结晶。
5)采用板框过滤机收集粗晶体，加粗晶体量50％去离子纯水，在10℃下进行洗涤2次，洗涤方式为搅拌30min，离心60min；洗涤后干燥即得。干燥后的晶体经液相检测含量为98.4％，晶体收率为68％，气相检测溶剂残留为0，液相检测塑化剂含量为0。
对比例1
本对比例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：
1)将聚唾液酸发酵液经过陶瓷膜过滤除菌体，将清液加热到70℃，使清液重的蛋白变性析出，加热半小时后，加活性炭脱色并吸附蛋白，加活性炭搅拌半小时，过滤并降温到室温，得到电导率为小于2000μs/cm的溶液，得到聚唾液酸；
2)向步骤1)得到的聚唾液酸中加入盐酸使ph＝1，80℃水解4小时，得到唾液酸；
3)使用超滤膜1kda除去未水解完全的聚唾液酸，得到sa清液；
4)向步骤3)得到的sa清液中加入氢氧化钠ph调节至6；
5)将步骤4)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，所述纳滤液中sa含量为80g/l；
6)将步骤5)得到的溶液使用冰醋酸将ph调至1，降温到2℃搅拌16小时，结晶。
7)采用转速为10000的离心机过滤机收集粗晶体，加粗晶体量2倍无水乙醇，在15℃下进行洗涤1次，洗涤方式为搅拌30min，离心10min；洗涤后干燥即得，干燥后的晶体经液相检测含量为97.0％，晶体收率为30％，气相检测溶剂残留，乙酸含量为5000ppm，乙醇含量为3000ppm，液相检测塑化剂含量为10ppm。
对比例2
本对比例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：
1)将唾液酸发酵液经过陶瓷膜过滤除菌体，将清液加热到70℃，使清液中的蛋白变性析出，加热半小时后，加活性炭脱色并吸附蛋白，加活性炭搅拌半小时，过滤并降温到室温，得到唾液酸清液；
2)向步骤1)得到的sa清液中加入氨水碱ph调节至6；
3)将步骤2)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热蒸发浓缩，以使所述纳滤液中sa含量500g/l；
4)将步骤3)得到的溶液加5倍的乙酸乙酯，降温到-10℃搅拌12小时，结晶。
5)采用转速为4000的离心机收集粗晶体，加粗晶体量4倍无水乙醇，进行洗涤1次，洗涤方式为搅拌30min，离心60min；洗涤后干燥即得。干燥后的晶体经液相检测含量为95.6％，晶体收率为69％，气相检测溶剂残留乙酸乙酯含量为8000ppm，乙醇含量为5000ppm，液相检测塑化剂含量为8ppm。
对比例3
本对比例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：
1)将燕窝水溶液ph调至1，80℃下水解4h，在70℃下加入活性炭反应30min，过滤，得到含有唾液酸的溶液；
2)向步骤1)得到的sa清液中加入氢氧化钠ph调节至7；
3)将步骤2)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热以使所述纳滤液中sa含量400g/l；
4)将步骤3)得到的溶液使用硫酸将ph调至0.5后，降温到4℃搅拌16小时，结晶。
5)采用板框过滤机收集粗晶体，加粗晶体量2倍无水乙醇，进行洗涤2次，洗涤方式为搅拌30min；洗涤后干燥即得。干燥后的晶体经液相检测含量为96.2％，晶体收率为66％，气相检测溶剂残留乙醇含量为5000ppm，液相检测塑化剂含量为10ppm。
对比例4
本对比例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：
1)将聚唾液酸发酵液经过陶瓷膜过滤除菌体，将清液加热到70℃，使清液重的蛋白变性析出，加热半小时后，加活性炭脱色并吸附蛋白，加活性炭搅拌半小时，过滤并降温到室温，得到电导率为小于2000μs/cm的溶液，得到聚唾液酸；
2)向步骤1)得到的聚唾液酸中加入硫酸使ph＝1，80℃水解4小时，得到唾液酸；
3)使用超滤膜1kda除去未水解完全的聚唾液酸，得到sa清液；
4)向步骤3)得到的sa清液中加入氢氧化钠ph调节至4；
5)将步骤4)得到的溶液使用真空加热蒸发浓缩以使所述纳滤液中sa含量为250g/l；
6)将步骤5)得到的溶液使用冰醋酸将ph调至1后，降温到2℃搅拌16小时，结晶。
7)采用板框过滤机收集粗晶体，加粗晶体量1倍无水乙醇，进行20℃下洗涤1次，洗涤方式为搅拌30min，过滤；洗涤后干燥即得，干燥后的晶体经液相检测含量为92.6％，晶体收率为66％，气相检测溶剂残留，乙酸含量为8000ppm，乙醇含量为2000ppm，液相检测塑化剂含量为10ppm。
对比例5
本对比例提供了一种提取n-乙酰神经氨酸的方法，包括如下步骤：
1)将唾液酸发酵液经过陶瓷膜过滤除菌体，将清液加热到70℃，使清液中的蛋白变性析出，加热半小时后，加活性炭脱色并吸附蛋白，加活性炭搅拌半小时，过滤并降温到室温，得到唾液酸清液；
2)向步骤1)得到的sa清液使用真空加热蒸发浓缩，以使所述浓缩液中sa含量500g/l
3)将步骤2)得到的溶液用5倍冰醋酸反应结晶，降温到2℃搅拌16小时，结晶。
4)采用板框过滤收集粗晶体，加粗晶体量4倍无水乙醇，进行洗涤1次，在20℃下洗涤方式为搅拌30min，过滤；洗涤后干燥即得。干燥后的晶体经液相检测含量为90.3％，晶体收率为67％，气相检测溶剂残留乙酸含量为8000ppm，乙醇含量为5000ppm，液相检测塑化剂含量为10ppm。
对比例6
1)将聚唾液酸发酵液经过陶瓷膜过滤除菌体，将清液加热到70℃，使清液中的蛋白变性析出，加热半小时后，加活性炭脱色并吸附蛋白，加活性炭搅拌半小时，过滤并降温到室温，得到电导率为小于2000μs/cm的溶液，得到聚唾液酸；
2)向步骤1)得到的聚唾液酸中加入盐酸使ph＝1，80℃水解4小时，得到唾液酸；
3)使用超滤膜1kda除去未水解完全的聚唾液酸，得到sa清液；
4)将步骤3)得到的溶液使用300da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，所述纳滤液中sa含量为100g/l
5)将步骤4)得到的溶液中加入乙酸乙酯；降温到2℃搅拌16小时，结晶，重复3次。
6)采用转速为10000的离心机过滤机收集粗晶体，加粗晶体量25％去离子纯水，在0℃下进行洗涤1次，洗涤方式为搅拌30min，离心10min；洗涤后干燥即得；干燥后的晶体经液相检测含量为95.1％，晶体收率为28％，气相检测溶剂残留，乙酸乙酯含量为8000ppm，液相检测塑化剂含量为5ppm。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。