一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状DNA病毒的多重RT-PCR检测方法与流程

本发明涉及一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状dna病毒的多重rt-pcr检测方法，属于病毒检测技术领域。

背景技术：

病毒病是世界各菠萝主产区的重要病害之一。菠萝在生长过程中，常遭受到病毒危害，病毒病严重影响菠萝果品产量和品质，目前已成为世界各产区菠萝产业健康发展的制约因子之一。菠萝被病毒侵染后，终生带毒，病毒在植株体内增殖、扩散，干扰和破坏了害病植株的正常生理机能，造成害病植株不能正常营养生长和开花结果，最后根系枯死、地上部皱缩失水，叶片逐渐褪绿变黄后变红，后期整株凋萎、死亡，结果株长势减退、果实多畸形、畸小等，导致产量下降、果实品质变劣、品种退化，对菠萝产业造成极大经济损失，对菠萝经济栽培造成严重影响。染病母株抽生的吸芽、顶芽、裔芽等无性繁殖材料均带毒，存在进一步扩散为害的潜在威胁。目前，我国已发现和鉴定的菠萝病毒主要有：菠萝凋萎相关病毒-1(pineapplemmealybugwilt-associatedviruse-1,pmwav-1)、菠萝凋萎相关病毒-2(pineapplemmealybugwilt-associatedviruse-2,pmwav-2)、菠萝凋萎相关病毒-3(pineapplemmealybugwilt-associatedviruse-3,pmwav-3)和菠萝杆状dna病毒(pineapplebacilliformcomosusvirus,pbcov)等4种。研究表明，pmwav-2和菠萝粉蚧(dysmicoccusspp.)共同危害引起菠萝凋萎病(pineapplemealybugwilt,pmw)，pmwav-1和pmwav-3在pmw的发展进程中也扮演着重要的角色。

pmw为害存在如下明显特点：一是病害样品常常呈现几种pmwavs复合侵染的现象，而pbcov与pmw发病虽无直接关系，但其往往伴随pmwavs共同出现在pmw显症植株中。二是田间常存在“隐症发病”现象，假阴性率较高，田间难以通过观察症状判断未显症植株是否携带病毒；三是发病程度与土壤水分含量呈负相关关系，即土壤水分含量越高时显症越不明显、水分含量偏低时更易显症，同时存在部分轻症、中症植株在水分充足的条件下可恢复“健康”的情况，为田间辨别增加了难度；四是菠萝植株一经病毒侵染，便终生带毒，且由其萌发的吸芽、顶芽、裔芽等无性繁殖材料均不同程度带毒，田间无法辨别，易造成带毒苗扩散、传播，一定程度上为后续病害大范围、快速扩散提供便利条件，对健康种苗生产推广和产业发展存在较大的潜在威胁。因此，建立一种简便、快速、灵敏、精准的，可同步检测多种菠萝病毒的多重rt-pcr检测方法，应用于检测菠萝各组织和种苗是否携带病毒以及未来可期的菠萝无毒种苗繁育显得极为迫切和重要。

目前，针对菠萝病毒检测的方法主要有免疫电镜检测、基于elisa技术的血清学检测、组织免疫印迹和普通rt-pcr检测。但这些方法都存在较大的限制因素，诸如免疫电镜操作要求和使用成本太高，血清学方法用病毒粒子提纯困难且灵敏度不高，组织免疫印迹易出现假阳性，常规rt-pcr操作繁琐、耗时长、耗费高且单次只能检测1种病毒、效率低等。而菠萝样品检测研究表明，田间菠萝普遍存在几种病毒复合侵染的现象，利用常规rt-pcr检测多种病毒的话就需要多次重复试验，耗时费力，成本也较高。多重rt-pcr是由rt-pcr结合多重pcr技术(multiplexpolymerasechainreaction,mpcr)建立起来的检测技术，其操作方法是在一个pcr反应体系中加入多对特异性引物，对同一体系中多种目的片段进行扩增，进而达到在同一体系同时检测到多个目标序列的目的，相较单一rt-pcr，该方法具有特异性强、省时简便、节省成本且灵敏度不受影响、能对多种病毒进行同步检测等优点，故而逐渐被广泛应用于动植物病毒病检测工作中。目前已有利用多重rt-pcr及其衍生技术对葡萄、马铃薯、葫芦科作物、香蕉病毒病害进行检测的报道，但未有关于同时检测3种菠萝凋萎相关病毒与菠萝杆状病毒dna病毒的相关文献和专利。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明提供一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状dna病毒(pbcov)的多重rt-pcr检测引物组合，以及应用该引物组合进行多重rt-pcr检测的方法。

本发明采取的技术方案如下：

一种用于同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状dna病毒的引物组合，所述引物组合包括：

用于特异性rt-pcr检测菠萝凋萎相关病毒-1(pineapplemmealybugwilt-associatedviruse-1,pmwav-1)的引物对i：

pmwav-1-f:5'-tccaaagctctgtgggagttgggt-3'

pmwav-1-r:5'-acgttgtgttcgccagaaccact-3'；

用于特异性rt-pcr检测菠萝凋萎相关病毒-2(pineapplemmealybugwilt-associatedviruse-2)的引物对ii：

pmwav-2-f:5'-tggcaacaatcccaacggaagc-3'

pmwav-2-r:5'-tcgccgaatggttcatgaggct-3'；

用于特异性rt-pcr检测菠萝凋萎相关病毒-3(pineapplemmealybugwilt-associatedviruse-3)的引物对iii：

pmwav-3-f:5'-aaccatgggcgcacaaaaccag-3'

pmwav-3-r:5'-cgctctctttacaagatgccaa-3'；以及

用于特异性rt-pcr检测菠萝杆状dna病毒(pineapplebacilliformcomosusvirus,pbcov)的引物对iv：

pbcov-f5'-tatccttgtatgcgtgcgtctac-3'

pbcov-r5'-gcagagtttccaaagtttcgtcac-3'。

本发明还提供了一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状dna病毒的多重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测菠萝样品总rna，并以rna为模板反转录制备获得第一链cdna；

2)以步骤1)中获得的cdna为模板，利用上述引物对组合，进行特异性pcr扩增反应；

3)用琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物；

4)分析pcr扩增结果。凝胶成像条件下，若482bp处有明显条带表明测试样本呈pmwav-1阳性，若612bp处有明显条带表明测试样本呈pmwav-2阳性，若327bp处有明显条带表明测试样本呈pmwav-3阳性，若851bp处有明显条带表明测试样本呈pbcov阳性，反之则为阴性。

优选的，本发明所述多重rt-pcr检测方法中，步骤1)具体为：提取待测菠萝样品总rna，向rnase-free的反应管中加入菠萝样品总rna模板5.0μl，10mm随机引物1.0μl，10mmdntps1.0μl，缓冲液2×rtbuffer10.0μl，m-mulv反转录酶1.0μl，rna酶抑制剂ribonucleaseinhibitor0.5μl和rnase-freewater1.0μl，于42℃孵育1h，即获得第一链cdna。

优选的，步骤2)中进行多重rt-pcr扩增使用的25μlpcr反应体系为：

步骤1)中所得的第一链cdna溶液1μl，5u/μltaq酶0.25μl，10×pcrbuffer(含mg²⁺)2.5μl，2.5mmdntp混合液2.5μl，10μm/μl上、下游引物各0.5μl和ddh2o14.75μl。

优选的，pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min保存。

优选的，步骤3)具体为：用tae电泳缓冲液配制备1.5％琼脂糖凝胶，取5μlrt-pcr产物进行电泳30min，根据电泳条带判定菠萝病毒种类。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)检测对象涵盖了当前我国菠萝产区已见报道的全部菠萝病毒种类，可在科学研究、预警监测、生产指导和生产等相关部门广泛推广，适用性广；

2)筛选获得的引物组合特异性强，灵敏度高，相互之间无明显干扰，各目标条带大小区分明显，电泳检测结果明显、条带清晰易辨、准确度高；

3)相较于普通血清学检测，本发明所建立的多重rt-pcr检测方法具有更高的灵敏度和准确度，实现了在同一反应体系中同步检测4种菠萝病毒的目的，较大程度地提高了工作效率，节约了检测成本。

4)本发明不仅为菠萝病毒病原检测提供了一种快速、简便、精准的检测技术手段，还可应用于菠萝病毒病害田间检测与监测、健康母本园选定与无毒苗培育、组培脱毒效果评价等工作中去。

附图说明

图1为筛选获得的引物组合特异性试验结果图；其中，l为pmwav-1阳性cdna模板、2为pmwav-2阳性cdna模板、3为pmwav-3阳性cdna模板、4为pbcov阳性cdna模板，m为dl2000plusdnamarker；

图2为单重rt-pcr扩增产物胶回收的结果图；其中，1为pmwav-1目的片段、2为pmwav-2目的片段、3为pmwav-3目的片段、4为pbcov目的片段，m为dl2000plusdnamarker；

图3为本发明实施例2所述多重rt-pcr反应体系和反应程序正交优化试验结果图；其中，1～16为表2中1～16号处理的rt-pcr扩增产物，m为dl1000dnamarker；

图4为本发明实施例2所述多重rt-pcr反应体系和反应程序正交优化试验结果图；其中，17～25为表2中17～25号处理的rt-pcr扩增产物，m为dl1000dnamarker；

图5为本发明实施例3所述应用本发明建立的方法检测田间菠萝样品带毒情况的试验结果图；其中，1为阴性对照，2～10分别为编号为1～9的田间样本，m为dl2000plusdnamarker。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例l3种菠萝凋萎相关病毒和杆状dna病毒的多重rt-pcr检测引物组合的获得

1.引物设计与合成

参考现有文献与genbank中已报道的pmwavs及pbcov相关基因序列(登录号nc_010178.1、eu769114.1、eu769114.1、af283103.1、dq225114.1、eu769116.1、dq399259.2、eu372003.1、ef467920.1、ef488753.1、eu377670.1、eu377670.1、eu377670.1)，分别运用dnaman、primerprimier5.0和oligo6.0等软件筛选、分析和设计多重rt-pcr引物对，其目的在于获得可应用于特异性扩增我国现阶段已确定存在于菠萝上的病毒的目标序列片段、相互之间无干扰的引物对序列，且能确保可在1.5％琼脂糖凝胶电泳中将各目标序列片段清楚、明晰的区分开。

最终，设计选取了表1中的pmwav-1(482bp)、pmwav-2(612bp)、pmwav-3(327bp)和pbcov(851bp)4对引物(分别对应序列表中的seqidno:1至seqidno:8)。使用常规pcr对其进行验证，可以看出，选取的引物可以清晰、特异的扩增到目标片段，引物二聚体不明显，各引物对之间无明显干扰(图1、2)，可用于下一步多重rt-pcr体系的建立试验。

表1应用于3种菠萝凋萎相关病毒和杆状dna病毒的多重rt-pcr检测引物组合序列及特征

实施例2菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状dna病毒多重rt-pcr体系建立和优化

1.取样部位与取样方法的确定

为了使所建立的多重rt-pcr技术有更广泛的适用性，根据菠萝凋萎相关病毒(pmwavs)和菠萝杆状dna病毒(pbcov)在菠萝植株内的分布特点，以及菠萝组织的多酚、多糖、高纤维特点，确定成株心叶、近成熟叶片整叶，以及顶芽、吸芽、裔芽的全部叶片整叶和地上茎都可以作为检测样本，同时宜选择叶片基部的白色幼嫩部分和地上茎中央幼嫩组织直接研磨提取样本总rna，花、果实和根因总rna提取难度较大、提取效率低而不推荐作为检测样本。

2.样本总rna的提取

分别称取0.1g的菠萝叶片基部白色组织，按照北京bioteke公司生产的多糖多酚植物总rna快速提取试剂盒(离心柱型)说明书步骤提取菠萝样本总rna，取5μlrna溶液于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测；用nd2000紫外分光光度计(美国thermonanodrop公司)测定其浓度，其余rna溶液置-80℃保存备用。

3.反转录

向rnase-free的1.5ml离心管中加入菠萝样品总rna模板5.0μl，10mm随机引物1.0μl，10mmdntps1.0μl，缓冲液2×rtbuffer10.0μl，m-mulv反转录酶1.0μl，rna酶抑制剂ribonucleaseinhibitor0.5μl和rnase-freewater1.0μl，于42℃孵育1h，获得第一链cdna，置于-20℃保存备用。

4多重pcr体系的建立与优化

以田间菠萝样品反转录获得的cdna为模板，在常规pcr单一检测4种目标菠萝病毒的基础上，建立25μl多重pcr体系。第一步，经过数次的单因子试验，确定了最佳的10×taqbuffer体积为2.5μl。第二步，基于l25(56)正交试验(表2)确定了各因子最优水平，即25μl反应体系下：dntps(2.5mm)体积为2.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)体积为0.25μl，引物组合中各引物体积分别为pmwav-1正向引物(10μm)0.5μl、pmwav-1反向引物(10μm)0.5μl、pmwav-2正向引物(10μm)0.5μl、pmwav-2反向引物(10μm)0.5μl、pmwav-3正向引物(10μm)0.5μl、pmwav-2反向引物(10μm)0.5μl、pbcov正向引物(10μm)0.5μl、pbcov反向引物(10μm)0.5μl和ddh2o14.75μl，cdna模板1μl。

同时，通过正交试验获得的最优多重rt-pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min保存。

表2基于l25(56)正交设计的3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状dna病毒多重rt-pcr检测体系与反应程序6个关键因子的试验设计表

5.病毒检测与结果判定

用1×tae电泳缓冲液配制备1.5％琼脂糖凝胶20ml(加1μlgoldview)，取5μl反应产物在1×tae缓冲液中，120v10a电泳30min，带条带的凝胶置于凝胶成像系统观察，根据电泳条带判定菠萝病毒种类。若482bp处有明显条带表明测试样本呈pmwav-1阳性，若612bp处有明显条带表明测试样本呈pmwav-2阳性，若327bp处有明显条带表明测试样本呈pmwav-3阳性，若851bp处有明显条带表明测试样本呈pbcov阳性，反之则为阴性。

实施例3田间样本的带毒检测及特异性验证

以采自某果园的菠萝叶片样品为试材，提取叶基白色幼嫩组织总rna为模板，验证本发明所建立的多重rt-pcr检测方法的实用性和可行性。

提取组织总rna、反转录、优化的多重pcr反应体系及程序同实施例2描述。结果表明，应用本发明建立的检测方法，能够从供试样本中检测到0～4种不等的目标菠萝病毒，其中携带2种以上病毒的样本占供试样本的比例达77.78％，这也进一步验证了菠萝病毒普遍存在复合侵染的现象。综合而言，本方法检测效果好、效率高(图5)。

为验证所建立的体系对目标病毒的检测特异性，对各目的电泳条带进行测序。测序结果提交genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行blast，结果显示，各条带对应的病毒序列与目标病毒的序列一致性均达100％，由此表明本发明建立的多重rt-pcr方法具有高度特异性，可推广应用于科学研究、预警监测、生产指导和生产等相关部门开展相关研究和实践工作，具有广泛的适用性和实用性。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110>海南省农业科学院热带果树研究所

<120>一种同步检测3种菠萝凋萎相关病毒和菠萝杆状dna病毒的多重rt-pcr检测方法

<141>2018-11-19

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tccaaagctctgtgggagttgggt24

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

acgttgtgttcgccagaaccact23

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tggcaacaatcccaacggaagc22

<210>4

<211>22

<212>dna

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tcgccgaatggttcatgaggct22

<210>5

<211>22

<212>dna

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aaccatgggcgcacaaaaccag22

<210>6

<211>22

<212>dna

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<400>6

cgctctctttacaagatgccaa22

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<211>23

<212>dna

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<400>7

tatccttgtatgcgtgcgtctac23

<210>8

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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