蛋白质GhCCoAOMT7在调控植物耐热性中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及蛋白质ghccoaomt7在调控植物耐热性中的应用。
背景技术：
：随着工业化进程的推进和人类活动的加剧，全球变暖趋势日益加重。2018年，中国气象局发布的《中国气候变化蓝皮书》中指出，2017年是全世界有完整气象观测记录以来的第二暖年份，中国是全球气候变化的敏感区和影响显著区。我国极端高温天气近年来频繁发生，区域平均气温呈上升趋势，而西北地区较南方增温速率更加明显，特别是西北新疆棉区的高温(≥35℃)逆境发生频繁。随着农业灌溉和气候因素的作用，高温势态日益严重，总体形势不容乐观，应对高温灾害已经刻不容缓(elfatiheltahir等，2018)。高温不仅对人类的生命健康产生危害(中国疾病预防控制中心，2014)，对植物的生长发育也会产生胁迫作用。棉花是世界性的重要纤维作物，同时也是一种重要的油料与生物能源作物，在国民经济和社会发展中占有重要地位。频繁发生的高温(≥35℃)逆境导致棉花蕾铃脱落严重、成铃发育畸形，造成棉花减产、纤维品质下降。高温时间持续越长，脱落率就越高，成为影响棉花产量及品质形成的重要环境影响因子之一。因此研究棉花耐热相关基因并增强棉花的耐热性，对提高棉花产量和品质具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是提高植物耐热性。本发明首先保护蛋白质ghccoaomt7在调控植物耐热性中的应用。上述应用中，所述蛋白质ghccoaomt7可为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐热性相关的蛋白质。其中，序列表中序列2由336个氨基酸残基组成。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的核酸分子在调控植物耐热性中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述编码蛋白质ghccoaomt7的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)编码区是序列表中序列1所示的dna分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质ghccoaomt7的dna分子；b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质ghccoaomt7的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列表中序列1由1011个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ghccoaomt7的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质ghccoaomt7的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ghccoaomt7，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质ghccoaomt7的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述任一所述的应用中，所述调控植物耐热性可为提高植物耐热性或降低植物耐热性。上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉tm-1；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)野生型拟南芥columbia-0亚型。本发明还保护培育转基因植物甲的方法或培育转基因植物乙的方法。所述培育转基因植物甲的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物相比，转基因植物甲的耐热性提高。上述方法中，所述“提高出发植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的表达量和/或活性的效果。上述方法中，所述“提高出发植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入编码所述蛋白质ghccoaomt7的核酸分子实现。上述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述蛋白质ghccoaomt7的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体甲实现；所述重组载体甲可为向表达载体插入编码所述蛋白质ghccoaomt7的核酸分子，得到的重组质粒。所述重组载体甲具体可为实施例提及的重组质粒35s::ghccoaomt7-eyfp。所述重组质粒35s::ghccoaomt7-eyfp具体可为向载体pezr-lny的限制性内切酶sali和bamhi的识别序列之间插入序列表中序列1自5’末端起第1至744位所示的双链dna分子，得到的重组质粒。所述转基因植物甲具体可为实施例提及的ghccoaomt7-oe6-11和ghccoaomt7-oe19-3。在本发明的一个实施例中，所述出发植物具体可为c1)、c2)、c5)、c6)和c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)生态型拟南芥columbia-0亚型。所述培育转基因植物乙的方法，可包括如下步骤：抑制出发植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物相比，转基因植物乙的耐热性降低。上述方法中，所述“抑制出发植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的表达量和/或活性”可通过基因定点编辑、rna干扰、同源重组、基因敲除等本领域熟知的方法，达到抑制所述蛋白质ghccoaomt7的表达量和/或活性的目的。上述方法中，所述“抑制出发植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的表达量和/或活性”可通过向出发植物中导入抑制所述蛋白质ghccoaomt7表达的物质实现。所述抑制所述蛋白质ghccoaomt7表达的物质可为抑制编码所述蛋白质ghccoaomt7的核酸分子的表达的物质。所述“抑制编码所述蛋白质ghccoaomt7的核酸分子的表达的物质”可通过向出发植物中导入重组质粒ptrv2-ghccoaomt7和载体ptrv1实现。所述重组质粒ptrv2-ghccoaomt7具体可为向载体ptrv2的限制性内切酶psti的识别序列间插入序列表中序列1自5'末端起第457至656位所示的dna分子。所述转基因植物乙具体可为实施例提及的陆地棉tm-1沉默株t2、t3、t5和t9。在本发明的一个实施例中，所述出发植物具体可为c1)-c4)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉tm-1。本发明还保护植物育种方法一或植物育种方法二。所述植物育种方法一，可包括如下步骤：增加植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的含量和/或活性，从而提高耐热性。所述植物育种方法二，可包括如下步骤：降低植物中上述任一所述蛋白质ghccoaomt7的含量和/或活性，从而降低耐热性。上述任一所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉tm-1；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)野生型拟南芥columbia-0亚型。实验证明，向野生型拟南芥中导入重组质粒35s::ghccoaomt7-eyfp，得到转ghccoaomt7基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转ghccoaomt7基因拟南芥的耐热性提高，具体表现为：存活率提高、“hsfa3基因、dreb2a基因、hsp101基因和hsp26基因的相对表达量提高”、花粉的萌发率提高和花粉管长度增加。向陆地棉tm-1中导入重组质粒ptrv2-ghccoaomt7和载体ptrv1，得到陆地棉tm-1沉默株；与陆地棉tm-1相比，陆地棉tm-1沉默株的耐热性降低，具体表现为株高降低和高温处理后植株茎尖达到半数萎蔫的时间缩短。由此可见，蛋白质ghccoaomt7可以调控植物的耐热性。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为转ghccoaomt7基因拟南芥的耐热性鉴定和real-timepcr检测转ghccoaomt7基因拟南芥中ghccoaomt7基因的表达量。图2为转ghccoaomt7基因拟南芥花粉的耐热性鉴定。图3为real-timepcr检测转ghccoaomt7基因拟南芥中hsfa3基因、dreb2a基因、hsp101基因和hsp26基因的相对表达量。图4为陆地棉tm-1沉默株耐热性的鉴定。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。陆地棉tm-1记载于如下文献中：tronlindernletal，1989，plantcellrep8:133-136.。公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。在下文中，陆地棉tm-1简称为tm-1。根癌农杆菌gv3101记载于如下文献中：郑银英，崔百明，常明进，彭明.转拟南芥ice1基因增强烟草抗寒性的研究.西北植物学报.2009年29卷1期.75-79.公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。载体ptrv1和载体ptrv2均记载于如下文献中：dongy，burch-smithtm，liuy，mamillapallip，dinesh-kumarsp.aligation-independentcloningtobaccorattlevirusvectorforhigh-throughputvirus-inducedgenesilencingidentifiesrolesfornbmads4-1and-2infloraldevelopment.plantphysiol.2007年145期.1161-1170.公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。野生型拟南芥(arabidopsisthaliana)(columbia-0亚型)记载于如下文献中：kimh,hyuny,parkj,parkm,kimm,kimh,leem,moonj,leei,kimj.ageneticlinkbetweencoldresponsesandfloweringtimethroughfveinarabidopsisthaliana.naturegenetics.2004,36:167-171，公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。在下文中，拟南芥(arabidopsisthaliana)(columbia-0亚型)简称野生型拟南芥。载体pezr-lny的核苷酸序列(环形)如序列表中序列3所示。phusion酶为赛默飞公司的产品。5×phusionbuffer为phusion酶中的组件。实施例1、蛋白质ghccoaomt7的编码基因(ghccoaomt7基因)的克隆1、采用trizo1法提取生长至14天的陆地棉tm-1幼苗的叶片的总rna，然后利用反转录酶amv反转录出第一链cdna，得到陆地棉tm-1的cdna。2、以步骤1获得的陆地棉tm-1的cdna为模板，采用forwardprimer：5’-atgatttgtttctcaagcatatatttg-3’和reverseprimer：5’-tcaacgaattcgcctgca-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到约750bp的双链dna分子。反应体系为50μl，由2μl模板(含1μg陆地棉tm-1的cdna)、1μlphusion酶、2.5μlforwardprimer水溶液(浓度为10μm)、2.5μlreverseprimer水溶液(浓度为10μm)、10μl5×phusionbuffe、10μldntpmixture(datp、dttp、dgtp和dctp的浓度均为10mmol)和22μlddh20组成。反应条件为：98℃3min；98℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；20℃5min；4℃保存。将步骤3得到的双链dna分子进行测序。测序结果表明，步骤3得到的双链dna分子(ghccoaomt7基因)的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第1至744位所示。实施例2、转ghccoaomt7基因拟南芥的获得及鉴定一、重组质粒35s::ghccoaomt7-eyfp和gv3101/35s::ghccoaomt7-eyfp的获得1、向载体pezr-lny的限制性内切酶sali和bamhi的识别序列之间插入序列表中序列1自5’末端起第1至744位所示的双链dna分子，得到重组质粒35s::ghccoaomt7-eyfp。重组质粒35s::ghccoaomt7-eyfp表达序列表中序列2所示的蛋白质ghccoaomt7。2、将重组质粒35s::ghccoaomt7-eyfp导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌，命名为gv3101/35s::ghccoaomt7-eyfp。将载体pezr-lny导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌，命名为gv3101/pezr-lny。二、转ghccoaomt7基因拟南芥的获得1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中clough，s.j.，andbent，a.f..floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj.(1998)16，735-743.)，将步骤一中2获得的gv3101/35s::ghccoaomt7-eyfp转至野生型拟南芥中，获得t1代转ghccoaomt7基因拟南芥种子。2、将步骤1获得的t1代转ghccoaomt7基因拟南芥种子播种于含有30mg/l的潮霉素的1/2ms培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为t1代转ghccoaomt7基因阳性苗，t1代转ghccoaomt7基因阳性苗收到的种子即为t2代转ghccoaomt7基因拟南芥种子。3、将步骤2筛选出的不同株系的t2代转ghccoaomt7基因拟南芥种子播种于含有30mg/l的潮霉素的1/2ms培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为ghccoaomt7基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为t3代转ghccoaomt7基因拟南芥种子。4、将步骤3筛选出的t3代转ghccoaomt7基因拟南芥种子再次播种于含有30mg/l的潮霉素的1/2ms培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为t3代纯合转ghccoaomt7基因拟南芥。将其中2个t3代纯合转ghccoaomt7基因拟南芥株系分别命名为ghccoaomt7-oe6-11(以下简称6-11或l6-11)和ghccoaomt7-oe19-3(以下简称19-3或l19-3)，并进行后续实验。按照上述方法，将gv3101/35s::ghccoaomt7-eyfp替换为gv3101/pezr-lny，其它步骤均相同，得到t3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。三、转ghccoaomt7基因拟南芥的鉴定1、转ghccoaomt7基因拟南芥的耐热性鉴定待测拟南芥种子为6-11的t3代种子、19-3的t3代种子、转空载体拟南芥的t3代种子或野生型拟南芥种子。(1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于1/2ms固体培养基上，4℃春化2天。(2)完成步骤(1)后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。(3)完成步骤(2)后，取所述待测拟南芥幼苗，先42℃黑暗处理2.5h，再22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天(目的为恢复)。(4)完成步骤(3)后，观察拟南芥的表型并统计存活率。部分存活率统计结果见图1中a(col为野生型拟南芥)。结果表明，高温(42℃)处理后，与野生型拟南芥相比，2个t3代纯合转ghccoaomt7基因拟南芥株系(6-11和19-3)的存活率均显著提高。转空载体拟南芥和野生型拟南芥的存活率无显著差异。2、real-timepcr检测转ghccoaomt7基因拟南芥中ghccoaomt7基因的表达量(1)将完成步骤1中(3)的待测拟南芥幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。(2)采用trizo1法提取待测样本的总rna，然后利用反转录酶amv反转录出第一链cdna。以该cdna作为模板，实时定量pcr检测ghccoaomt7基因的表达量。检测ghccoaomt7基因的引物为5’-actggtgaaagttggcggat-3’和5’-attcgcctgcagatggtcaa-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第540至740位所示。将野生型拟南芥幼苗中ghccoaomt7基因的表达量作为1，部分拟南芥幼苗中ghccoaomt7基因的相对表达量见图1中b(col为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，2个t3代纯合转ghccoaomt7基因拟南芥株系(6-11和19-3)中ghccoaomt7基因的相对表达量均显著提高；转空载体拟南芥幼苗和野生型拟南芥幼苗中ghccoaomt7基因的相对表达量无显著差异。步骤1中拟南芥株系的耐热性越高(表现为存活率越高)，则相应幼苗的ghccoaomt7基因的相对表达量越高。3、转ghccoaomt7基因拟南芥花粉的耐热性鉴定花粉培养基的溶质及其浓度为20mmkcl、200mmcacl2、20mmmgso4、30mm硼酸、5mmmes、1％(w/v)肌醇、18％(w/v)蔗糖和1％(w/v)琼脂糖，溶剂为水，ph值为5.8。待测拟南芥种子为6-11的t3代种子、19-3的t3代种子、转空载体拟南芥的t3代种子或野生型拟南芥种子。(1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于1/2ms固体培养基上，4℃春化2天。(2)完成步骤(1)后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)4周，得到待测拟南芥植株。(3)完成步骤(2)后，采集待测拟南芥植株的花粉，然后铺于花粉培养基上，32℃(高温)或28℃(常温)暗处理6h。(4)完成步骤(3)后，观察花粉的表型，测量花粉的萌发率和花粉管长度。部分表型结果见图2中a(col为野生型拟南芥)。部分花粉的萌发率统计结果见图2中b(col为野生型拟南芥)。部分花粉的花粉管长度统计结果见图2中c(col为野生型拟南芥)。结果表明，花粉经过高温(32℃)处理后，与野生型拟南芥相比，2个t3代纯合转ghccoaomt7基因拟南芥株系(6-11和19-3)的花粉的萌发率显著提高，花粉管长度显著增加。4、real-timepcr检测转ghccoaomt7基因拟南芥中hsfa3基因、dreb2a基因、hsp101基因和hsp26基因的表达量待测拟南芥种子为6-11的t3代种子、19-3的t3代种子、转空载体拟南芥的t3代种子或野生型拟南芥种子。(1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于1/2ms固体培养基上，4℃春化2天。(2)完成步骤(1)后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。(3)完成步骤(2)后，取所述待测拟南芥幼苗，先42℃黑暗处理0h、0.5h或1h，再22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天(目的为恢复)。将待测拟南芥幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。(4)采用trizo1法提取待测样本的总rna，然后利用反转录酶amv反转录出第一链cdna。以该cdna作为模板，实时定量pcr检测待测基因(hsfa3基因、dreb2a基因、hsp101基因或hsp26基因)的表达量。将野生型拟南芥幼苗中待测基因的表达量作为1，部分拟南芥幼苗中待测基因(hsfa3基因、dreb2a基因、hsp101基因或hsp26基因)的相对表达量见图3。结果表明，对拟南芥进行高温处理0.5h或1h后，拟南芥幼苗中待测基因的相对表达量均显著提高且t3代纯合转ghccoaomt7基因拟南芥株系(6-11和19-3)的相对表达量均显著高于野生型拟南芥，转空载体拟南芥和野生型拟南芥中待测基因的相对表达量无显著差异。步骤1中拟南芥株系的耐热性越高(表现为存活率越高)，则相应幼苗的hsfa3基因、dreb2a基因、hsp101基因和hsp26基因的相对表达量越高。上述结果表明，在野生型拟南芥中过表达ghccoaomt7基因可以提高拟南芥的耐热性；耐热性提高表现为：存活率提高、“hsfa3基因、dreb2a基因、hsp101基因和hsp26基因的相对表达量提高”、花粉的萌发率提高和花粉管长度增加。实施例3、陆地棉tm-1沉默株的获得及鉴定侵染溶液：含10mmmes、10mmmgcl2和200mm乙酰丁香酮的水溶液。一、重组质粒ptrv2-ghccoaomt7的构建和重组农杆菌的获得1、采用trizo1法提取生长至14天的陆地棉tm-1幼苗的叶片的总rna，然后利用反转录酶amv反转录出第一链cdna，得到陆地棉tm-1的cdna。2、以步骤1获得的陆地棉tm-1的cdna为模板，采用引物f：5’-cgacgacaagaccctaaagataatgaagggagttttgatttt-3’和引物r：5’-gaggagaagagcccttctatgatcgacctcctcgatt-3’组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。反应体系为50μl，由2μl模板(含1μg陆地棉tm-1的cdna)、1μlphusion酶、2.5μl引物f水溶液(浓度为10μm)、2.5μl引物r水溶液(浓度为10μm)、10μl5×phusionbuffer、10μldntpmixture(datp、dttp、dgtp和dctp的浓度均为10mmol)和22μlddh20组成。反应条件为：98℃3min；98℃30s，60℃30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；20℃5min；4℃保存。3、完成步骤2后，取所述pcr扩增产物，回收约200bp的dna片段。将该dna片段置于含有datp的t4dna合成酶缓冲液中，22℃处理30min，然后70℃放置20min，得到片段甲。4、将载体ptrv2用限制性内切酶psti酶切8h，回收酶切产物。将该酶切产物置于含有dttp的t4dna合成酶缓冲液中，22℃处理30min，然后70℃放置20min，得到载体骨架。5、将片段甲和载体骨架混合，65℃连接2min，得到重组质粒ptrv2-ghccoaomt7。将重组质粒ptrv2-ghccoaomt7进行测序。根据测序结果，重组质粒ptrv2-ghccoaomt7为向载体ptrv2的限制性内切酶psti的识别序列间插入序列表中序列1自5'末端起第457至656位所示的dna分子。将重组质粒ptrv2-ghccoaomt7导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌，命名为gv3101/ptrv2-ghccoaomt7。将载体ptrv1导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌，命名为gv3101/ptrv1。二、陆地棉tm-1沉默株的获得1、取gv3101/ptrv2-ghccoaomt7的单菌落，接种至4ml含100mg/l利福平(rif)和50g/l卡那霉素(kan)的lb液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养24h，得到培养菌液1。2、完成步骤1后，取培养菌液1，按体积比为1：100接种至含100mg/l利福平(rif)和50g/l卡那霉素(kan)的lb液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养6h，得到培养菌液2。培养菌液2的0d600nm为0.5左右。3、完成步骤1后，取培养菌液2，5000rpm离心5min，得到沉淀1，然后用50ml侵染溶液重悬，得到侵染液甲。4、将步骤1至3中的gv3101/ptrv2-ghccoaomt7替换为gv3101/ptrv1，其它步骤均不变，得到侵染液乙。5、将步骤3得到的侵染液甲和步骤4得到的侵染液乙混合(体积比为1:1)，得到侵染工作液；用该侵染工作液侵染生长至10天的陆地棉tm-1幼苗的子叶，得到10株陆地棉tm-1拟沉默株，依次将其命名为t1～t10。6、完成步骤5两周后，采用trizo1法分别提取10株陆地棉tm-1拟沉默株和生长至24天的陆地棉tm-1幼苗的总rna，然后利用反转录酶amv反转录出第一链cdna。以该cdna为模板，实时定量pcr检测ghccoaomt7基因的表达量。检测ghccoaomt7基因的引物为5’-actggtgaaagttggcggat-3’和5’-attcgcctgcagatggtcaa-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第540至740位所示。实验结果表明，与陆地棉tm-1幼苗的ghccoaomt7基因的表达量相比，t2、t3、t5和t9中ghccoaomt7基因的表达量均显著降低。因此，t2、t3、t5和t9均为陆地棉tm-1沉默株。以t2、t3、t5和t9为研究材料进行后续的实验，在下文统一命名为vigs-ghccoaomt7。按照上述步骤，将gv3101/ptrv2-ghccoaomt7替换为gv3101/ptrv2(将载体ptrv2导入根癌农杆菌gv3101得到的重组农杆菌)，其它步骤均不变，得到转空载体沉默株。三、陆地棉tm-1沉默株的鉴定1、陆地棉tm-1沉默株的表型鉴定取生长至8周的待测棉花植株(vigs-ghccoaomt7、转空载体沉默株或陆地棉tm-1)，观察待测棉花植株的地上部分和叶片的表型。结果表明，vigs-ghccoaomt7植株矮化；转空载体沉默株和陆地棉tm-1的株高无显著差异，均显著高于vigs-ghccoaomt7植株。2、real-timepcr检测陆地棉tm-1沉默株中ghccoaomt7基因的表达量(1)取生长至8周的待测棉花植株(vigs-ghccoaomt7、转空载体沉默株或陆地棉tm-1)的叶片，放入液氮保存，得到相应的待测样本。(2)采用trizo1法提取待测样本的总rna，然后利用反转录酶amv反转录出第一链cdna。以该cdna作为模板，实时定量pcr检测ghccoaomt7基因的表达量。检测ghccoaomt7基因的引物为5’-actggtgaaagttggcggat-3’和5’-attcgcctgcagatggtcaa-3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第540至740位所示。将陆地棉tm-1中ghccoaomt7基因的表达量作为1，vigs-ghccoaomt7中ghccoaomt7基因的相对表达量见图4中c(ck为转空载体沉默株)。结果表明，与转空载体沉默株相比，vigs-ghccoaomt7中ghccoaomt7基因的表达量显著下降。转空载体沉默株和陆地棉tm-1中ghccoaomt7基因的相对表达量无显著差异。3、陆地棉tm-1沉默株的耐热性鉴定实验重复三次取平均值，每个重复的步骤为：取生长至8周的20棵待测棉花植株(vigs-ghccoaomt7、转空载体沉默株或陆地棉tm-1)，42℃(高温)光暗交替培养(14h光照培养/10h暗培养)，观察待测棉花植株的株高和茎尖并记录植物茎尖达到半数萎蔫的高温处理天数。茎尖表型见图4中a(normal为正常状态的茎尖，wilting为萎蔫状态的茎尖)，部分待测棉花茎尖达到半数萎蔫的高温处理天数的统计结果见图4中b(ck为转空载体沉默株)。结果表明，高温处理6天后vigs-ghccoaomt7的茎尖达到半数萎蔫；高温处理27天后转空载体沉默株和陆地棉tm-1的茎尖才达到半数萎蔫。与转空载体沉默株相比，vigs-ghccoaomt7的株高显著降低；转空载体沉默株和陆地棉tm-1的株高无显著差异。上述结果表明，在陆地棉tm-1中沉默ghccoaomt7基因均可降低耐热性；耐热性降低表现为株高降低和高温处理后植物茎尖达到半数萎蔫的时间缩短。<110>中国科学院植物研究所<120>蛋白质ghccoaomt7在调控植物耐热性中的应用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>747<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgatttgtttctcaagcatatatttgaagagtatggaatttacaacagccgaaccattt60ctccataaggggttgttgcagagttttgagttaactaagtatatcttgaagaccaacgtc120taccctagggaaccatcacctctaaaggagctccgagaagttactgcaaagcatccaggg180aattttatgagcacaacaccagattcaggtcaactaatggggatgttacttaagctaatt240aatgcaaagaagacgattgaaattggtgtttacaccggctattctcttctcctcactgct300ctttcaatccctcacgatgctatgattatagccatagatccaaacaaggaaacatatgag360ataggccttcccattatccaaaaagcaggtgtggaacacaaaatcaacttcattgaatcc420caagctttaccagttctggacaagcttcttcaaaataaagataatgaagggagttttgat480tttgcatttgtcgatgcggataaagaaaattacctgaattaccacgagaggcttctgaaa540ctggtgaaagttggcggattgatcgtctttgacaacacgctttggggaggcacggtggct600caacccgaagaggcggtttcagaagatagaaaggaatcgaggaggtcgatcatagagttt660aacaactcagtttcaatcgatcaacgcatcgaaatcgctctcactccgtcgggtgatggg720ttgaccatctgcaggcgaattcgttga747<210>2<211>248<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2metilecyspheserseriletyrleulyssermetgluphethrthr151015alaglupropheleuhislysglyleuleuglnserphegluleuthr202530lystyrileleulysthrasnvaltyrproarggluproserproleu354045lysgluleuarggluvalthralalyshisproglyasnphemetser505560thrthrproaspserglyglnleumetglymetleuleulysleuile65707580asnalalyslysthrilegluileglyvaltyrthrglytyrserleu859095leuleuthralaleuserileprohisaspalametileilealaile100105110aspproasnlysgluthrtyrgluileglyleuproileileglnlys115120125alaglyvalgluhislysileasnpheilegluserglnalaleupro130135140valleuasplysleuleuglnasnlysaspasngluglyserpheasp145150155160phealaphevalaspalaasplysgluasntyrleuasntyrhisglu165170175argleuleulysleuvallysvalglyglyleuilevalpheaspasn180185190thrleutrpglyglythrvalalaglnprogluglualavalserglu195200205asparglysgluserargargserileileglupheasnasnserval210215220serileaspglnargilegluilealaleuthrproserglyaspgly225230235240leuthrilecysargargilearg245<210>3<211>11726<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3catgccaaccacagggttcccctcgggatcaaagtactttgatccaacccctccgctgct60atagtgcagtcggcttctgacgttcagtgcagccgtcttctgaaaacgacatgtcgcaca120agtcctaagttacgcgacaggctgccgccctgcccttttcctggcgttttcttgtcgcgt180gttttagtcgcataaagtagaatacttgcgactagaaccggagacattacgccatgaaca240agagcgccgccgctggcctgctgggctatgcccgcgtcagcaccgacgaccaggacttga300ccaaccaacgggccgaactgcacgcggccggctgcaccaagctgttttccgagaagatca360ccggcaccaggcgcgaccgcccggagctggccaggatgcttgaccacctacgccctggcg420acgttgtgacagtgaccaggctagaccgcctggcccgcagcacccgcgacctactggaca480ttgccgagcgcatccaggaggccggcgcgggcctgcgtagcctggcagagccgtgggccg540acaccaccacgccggccggccgcatggtgttgaccgtgttcgccggcattgccgagttcg600agcgttccctaatcatcgaccgcacccggagcgggcgcgaggccgccaaggcccgaggcg660tgaagtttggcccccgccctaccctcaccccggcacagatcgcgcacgcccgcgagctga720tcgaccaggaaggccgcaccgtgaaagaggcggctgcactgcttggcgtgcatcgct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