一种醋酸杆菌工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种醋酸杆菌工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

3-羟基丙酸是一种新兴的高附加值平台化合物，能合成多种重要的化学物质，如丙二酸、丙烯酸以及高强度、高热稳定性和生物可降解性能的聚3-羟基丙酸酯，被美国能源部列为当前世界上12种最具潜力的化工产品之一。

醋酸杆菌acetobactersp.cgmcc8142为本团队筛选获得，具有高效的催化1，3-丙二醇合成3-hp的能力，是一种高效的生物催化剂，然而在研究过程中发现，醋酸杆菌cgmcc8142在获取高效催化性能的培养基(甘油与葡萄糖)中生长性能较差，葡萄糖易被醋酸杆菌膜结合葡萄糖脱氢酶(gdh)氧化为葡萄糖酸，使培养液ph迅速降低，限制了甘油的利用，对菌体生长和催化均不利，限制了其进一步扩大生产的可能。且目前对醋酸杆菌的生物量培养主要集中于培养基优化上，通过基因工程改造提高醋酸杆菌对碳源的利用率尚无报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种醋酸杆菌工程菌，是在醋酸杆菌acetobactersp.cgmcc8142的基因组上敲除了葡萄糖脱氢酶基因。

所述acetobactersp.cgmcc8142引用自lij,zongh,zhugeb,etal.immobilizationofacetobactersp.cgmcc8142forefficientbiocatalysisof1,3-propanediolto3-hydroxypropionicacid[j].biotechnology&bioprocessengineering,2016,21(4):523-530，已于2013年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:8142，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明的第二个目的是提供上述醋酸杆菌工程菌的构建方法，所述方法包括：

(1)构建基因敲除质粒；

(2)将基因敲除质粒转化至acetobactersp.感受态细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述基因敲除质粒是以pk18mobsacb为载体，表达含seqidno.2所示的acetobactersp.cgmcc8142来源的膜结合葡萄糖脱氢酶基因同源前臂基因和含seqidno.3所示的acetobactersp.cgmcc8142来源的膜结合葡萄糖脱氢酶基因同源后臂基因。

本发明的第三个目的是提供上述的醋酸杆菌工程菌在催化生化反应中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述的醋酸杆菌工程菌在生产3-羟基丙酸、丙烯酸、1，3-丙二醇、丙二酸或聚3-羟基丙酸中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述的醋酸杆菌工程菌在食品或饲料领域的应用。

本发明的第六个目的是提供上述的醋酸杆菌工程菌在制备食品或饲料的添加剂或防腐剂方面的应用。

本发明的第七个目的是提供上述的醋酸杆菌工程菌在化工或制药领域的应用。

本发明的第八个目的是提供上述的醋酸杆菌工程菌制备生物可降解热塑性聚酯、杀虫剂、涂料、胶黏剂、增塑剂或乳化剂方面的应用。

本发明取得的有益效果：本发明构建了一种醋酸杆菌工程菌acetobactersp.△gdh，将该菌株置于最适催化性能培养基中培养时，消除了葡萄糖脱氢酶催化引起的糖酸的积累，从而促进菌体对甘油的利用。将该菌株培养72h后，其od600值较野生菌提高了1.72倍，ph也不再快速下降，更适应大规模应用。

附图说明

图1：敲除载体构建示意图。

图2：基因敲除示意图，图中的黑色片段为拟敲除基因gdh片段。

图3：gdh基因敲除前后电泳图，泳道1为分子量标准，泳道2为敲除前的gdh基因，泳道3为敲除后的gdh基因。

图4：gdh基因敲除后acetobactersp.cgmcc8142工程菌的生长变化图。

图5：gdh基因敲除后acetobacterindonesiensis工程菌的生长变化图。

具体实施方式

(一)培养基

种子培养基：甘油12g/l，蛋白胨10g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o1g/l。

最适催化性能培养基：甘油12g/l，葡萄糖8g/l，蛋白胨10g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o1g/l；配制固体培养基时加入琼脂粉2％。

卡那霉素工作浓度：50μg/ml。

下述实施例中，没有多作说明的，都是采用常规的分子生物学实验方法。

实施例1基因敲除质粒的构建

(1)在ncbi数据库中查找与acetobactersp.cgmcc8142的16srdna序列同源性较高的acetobacterindonesiensis5h-1的全基因组序列，依据acetobacterindonesiensis5h-1的膜结合葡萄糖脱氢酶gdh基因序列(如seqidno.1所示)，设计基因敲除同源臂引物与基因敲除验证引物和抗性标记引物，如表1所示。其中同源臂扩增引物扩增产物约为1500bp，抗性标记扩增产物约为900bp，敲除验证扩增产物约为2000bp。

表1gdh基因敲除同源臂扩增引物、抗性标记引物以及敲除后验证引物

提取acetobactersp.cgmcc8142基因组dna为模板，分别用含有同源重组连接同源臂和酶切位点的引物gdh1-f1、gdh1-r1和gdh2-f1、gdh2-r1扩增基因敲除同源臂。

pcr体系：extaq酶0.5μl，10×buffer5μl，模板1μl，dntp4μl，引物各1.5μl，ddh2o36.5μl。

rcr程序：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃90s，30个循环，72℃延伸10min。

将电泳验证正确的基因敲除同源臂(mgdh1、mgdh2)扩增产物通过同源重组连接到puc19载体中，然后将抗性标记kan扩增产物通过酶切连接(kpni/xhoi)到基因敲除同源臂之间，最后将含基因敲除同源臂(mgdh1、mgdh2)以及抗性标记(kan)的质粒puc-2与自杀质粒pk18mobsacb用相同的限制性内切酶bamhi/hindiii酶切后回收，经连接转化即可成功构建基因敲除质粒pk18-gdh。酶切连接过程如图1所示。

实施例2电转感受态的制备

(1)挑取acetobactersp.单菌落于种子培养基中，在往复式摇床，30℃、100rpm条件下培养20-24h。

(2)按2％接种量，将一级种子液转接于50ml种子培养液中，培养菌液od600值为0.3-0.8之间再于冰上冷却30min。

(3)于4℃冷冻离心机中，5000rpm条件下离心5min收集菌体。

(4)加入预冷的10％甘油，轻轻吹洗菌体，静止10min后再次离心收集菌体，操作如步骤(3)所述，重复步骤3次。

(5)倒掉上清液后加入预冷过的10％甘油，使菌体重新悬浮，分装至新的1.5ml离心管中，每管约为100-200μl。

实施例3基因敲除质粒电击转化acetobactersp.电转感受态

(1)吸取10μl高浓度基因敲除质粒，加入电转感受态中，轻轻吹吸混匀后于冰上冷却10min。

(2)将上述混有质粒的感受态细胞迅速吸取并加入到预冷的电转杯中进行电击，电压设置为2500v，电击时间设置为5ms。

(3)电击后迅速吸取种子培养基于电转杯中，轻轻吹吸混匀后将全部菌液转移到新的离心管中，于往复式摇床中，30℃、100rpm条件下培养6h，然后吸取200μl转接到无抗种子培养基中培养20h左右，再吸取200μl转接至无抗种子培养基中培养20h，然后用生理盐水梯度稀释涂布到含有卡那霉素的抗性平板中，培养2-3d。

(4)利用引物gdh-f1、gdh-r1进行菌落pcr验证，对pcr验证正确的单菌落进行液体培养，提取基因组dna后利用引物gdh-f1、gdh-r1进一步进行pcr验证，验证正确说明gdh基因缺失菌构建成功。

自杀质粒利用两次同源重组将基因敲除，两次同源重组过程如图2所示，第一次同源重组后，自杀载体质粒整合至基因组；第二次同源重组后，自杀载体质粒脱离基因组，图中黑色片段为敲除后基因片段。

gdh基因敲除前后对比电泳如图3所示。

实施例4.醋酸杆菌工程菌在最适催化性能培养基中的生长情况

通过摇瓶发酵，30℃，200rpm，培养于最适催化性能培养基，发酵72h，期间不定时取样通过分光光度计测od600并检测ph，见图4，通过敲除后，缺失菌培养液ph不再迅速下降，发酵72h后，醋酸杆菌工程菌的ph值为5.84，而野生型醋酸杆菌的ph值为3.25，od600值较野生菌提高了1.72倍。

对比例1将醋酸杆菌的宿主换为acetobacterindonesiensis，其余条件与实施例中一致

将acetobacterindonesiensis的gdh基因敲除后获得另一种醋酸杆菌工程菌a.indonesiensis△gdh。

通过摇瓶发酵，将该工程菌a.indonesiensis△gdh在30℃，200rpm，培养于最适催化性能培养基，发酵72h，不定时取样通过分光光度计测od600并检测ph，见图5，通过敲除后，缺失菌培养液ph不再迅速下降，发酵36h后，醋酸杆菌工程菌的ph值为5.45，而野生型醋酸杆菌的ph值为3.42，但od600值较野生菌下降了30％以上。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

<120>一种醋酸杆菌工程菌及其应用

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