本发明涉及一种产脂肪酶的耐高温枯草芽孢杆菌及其在堆肥中的应用，属环境生物技术领域。
背景技术：
我国人口众多，是垃圾产生大国，根据住建部发布的城市垃圾统计数据，每年，我国城市垃圾产生量已经大于两亿吨；还有1500多个县城产生了接近0.7亿吨的垃圾；至于村镇垃圾方面，由于村镇数量太分散，暂无准确统计数据。总体来看，我国生活垃圾产生量在四亿吨以上。我国生活垃圾最主要的构成部分是厨余垃圾，超过60％，有的地区甚至达到70％至80％，而欧美国家主要的生活垃圾是纸张，厨余垃圾只占到25％。此外，餐厨垃圾含水率高；易腐烂变质，污染环境。餐厨垃圾的有机质含量高，好氧堆肥处理是实现其资源化与无害化的重要途径之一。
然而，餐厨垃圾中粗脂肪含量有时达25％，粗脂肪含量越高，物料粘度较大，通气性及松散度均变差，好氧堆肥过程中易产生厌氧环境，不利于好氧堆肥过程的进行。另一方面，脂肪基本不溶于水，微生物降解效果差，当温度较高时，餐厨垃圾中的脂肪易乳化，可改善其与微生物的接触状态，提高降解效率。因此，筛选耐高温的脂肪降解菌、研发含有不同微生物菌种及复配比例的复合微生物菌剂对加快含油餐厨垃圾的堆肥化进程、提高堆肥化效率和成品品质意义重大。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种产脂肪酶的耐高温枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisstrain)b211，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018475，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。该菌株的发酵培养条件为：温度25-37℃，通气量0.8-1.5vvm，搅拌转速200-600r/min，溶解氧大于15％，ph值6.5-7.5。
本发明的第二个目的是提供含有上述耐高温枯草芽孢杆菌b211的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205和深绿木霉(trichodermaatroviride)。
在本发明的一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformisstrain)b105，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018470，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述嗜热短芽芽孢杆菌(bacillusthermoruberstrain)b205，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018472，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)与深绿木霉(trichodermaatroviride)可选用商业化的菌株，包括但不限于lysinibacillusfusiformisatcc7055、trichodermaatrovirideimi206040。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌数之比为18-28:2-3:0.5-1.5:800-1200:2.8-3.3。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂的活菌总数为1.0×109-1.0×1010cfu/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂的活菌总数为1.0×109-1.0×1010cfu/g。
本发明的第三个目的是提供所述微生物菌剂的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于促进含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与秸秆混合堆肥。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂的制备方法为：将耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉分别接种至培养基中，获得耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的发酵液，将获得的发酵液按比例混合，添加载体辅料，得到包含耐高温枯草芽孢杆菌b211的液态复合微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述载体辅料包括但不限于褐煤、沸石、石粉中的一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，所述复合微生物菌剂的制备方法为：将耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的发酵液按比例混合，添加粉碎秸秆、炭化秸秆、麸皮中的一种或几种，热风干燥后，得到包含耐高温枯草芽孢杆菌b211的固态复合微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述获得耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105与嗜热短芽芽孢杆菌b205的发酵液为将耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105与嗜热短芽芽孢杆菌b205分别接种至高温灭菌后的营养肉汤培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％-10％(v/v)，静置培养20-40h；所述耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌b105的培养温度为25-37℃；所述嗜热短芽芽孢杆菌b205的培养温度为30-60℃；当活菌数大于或等于1×108cfu/ml时，获得所述耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105与嗜热短芽芽孢杆菌b205的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述营养肉汤培养基为高温灭菌后的营养肉汤培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述营养肉汤培养基的成分包含牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml。
在本发明的一种实施方式中，所述获得深绿木霉的发酵液为将深绿木霉分别接种至高温灭菌后的马铃薯葡萄糖培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％-10％(v/v)，静置培养20-30h，培养温度为20-30℃；当活菌数大于或等于1×108cfu/ml时，获得所述深绿木霉的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述马铃薯葡萄糖培养基为高温灭菌后的马铃薯葡萄糖培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述马铃薯葡萄糖培养基的成分包含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，水1000ml。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂的应用方法包含如下步骤：
(1)将所述复合微生物菌剂和堆肥原料按照0.5-1：100的质量比进行混合；
(2)将混合物堆制堆肥，测量堆体温度，按照温度变化进行翻堆。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)为将所述混合物堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量堆体温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，堆制结束。
本发明的有益效果：
(1)本发明公开了一株产脂肪酶的耐高温枯草芽孢杆菌b211。该菌株产脂肪酶，且耐高温，具有较好的脂肪降解能力，具有极为广阔的市场应用前景。
(2)本发明提供的这种堆肥复合微生物菌剂，可用于含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与秸秆混合堆制堆肥，较好实现上述混合废弃物的资源化利用。
(3)本发明提供的这种复合微生物菌剂，堆制2d后，可使堆肥原料中脂肪的降解率达81.9％-95.7％，而对照实验中脂肪降解率为56.9％。
(4)本发明提供的这种微生物菌剂在堆制堆肥时优势明显，可有效缩短堆体升温时间，使得堆体达到高温55℃所需时间由对照实验的62h缩短至16-32h。
(5)本发明提供的这种微生物菌剂在堆制堆肥时优势明显，可有效提高堆体的最高温度，使得堆体达到的最高温度由对照实验的59℃提高至61-66℃。
(6)本发明提供的这种微生物菌剂在堆制堆肥时优势明显，可改善堆肥的无害化效果，堆肥结束时，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为71-93个/g与96.0％-98.7％，而对照实验分别为110个/g与91.8％。
生物材料保藏
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisstrain)b211，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018475，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformisstrain)b105，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018470，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
嗜热短芽芽孢杆菌(bacillusthermoruberstrain)b205，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018472，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
具体实施方式
检测方法参见我国生物有机肥质量标准(ny884-2012)。
具体实施方式中，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)与深绿木霉(trichodermaatroviride)可选用商业化的菌株lysinibacillusfusiformisatcc7055、trichodermaatrovirideimi206040，但不受限于上述菌株。
实施例1耐高温枯草芽孢杆菌b211的筛选
(1)将含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按质量比0.5：1：1的比例混合，接种5％(w/w)的江苏省无锡市某区夏季腐叶，混合物料的含水率为55％，c/n比为25，混合均匀后堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量堆体温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样；
(2)称取堆肥样品10g，放入装有90ml灭菌水的三角烧瓶中，120r/min摇床震荡1h，得到10-1稀释液，并依次制成10-4、10-5和10-6的三种堆肥样品稀释液，分别吸取上述三种稀释液100μl均匀涂布于营养琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基和马铃薯琼脂培养基平板上，分别置于55℃的培养箱中倒置培养1～7d，然后反复划线分离，直至获得纯菌株；
(3)将适量1.6％中性红水溶液直接滴浸于菌落表面，若呈深蓝色，则该菌株为产脂肪酶菌株，可降解脂肪，并可据颜色深浅判断菌株的产脂肪酶能力，颜色越深产脂肪酶能力越强，最终获得产脂肪酶且降解脂肪能力最强的纯菌株。
实施例2耐高温枯草芽孢杆菌b211的鉴定
在营养琼脂培养基平板上于30℃培养过夜后，形成米黄色，裂片状，表面湿润，中间凸起，边缘不规则的菌落，用光学显微镜观察呈革兰氏染色阳性，杆状，产芽孢。
采用16srdna测序进行分类学分子鉴定，将测序结果(1496bp)在ncbi中进行blast比对，发现其16srdna碱基序列与枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisstrain)的相似性最高。
综合上述形态特征、生理生化特征及遗传性特征，可鉴定该产脂肪酶菌株为耐高温的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisstrain)，将其命名为枯草芽孢杆菌b211，并于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno.m2018475。
对菌株产脂肪酶的能力进行验证。将菌株接种至营养琼脂培养基平板上，30℃培养25h，然后划线转接于营养肉汤培养基中，30℃培养25h。将发酵液离心，采用碱滴定法测定脂肪酶活力，经测定，脂肪酶酶活为9.1u/ml。
将含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按质量比0.75：0.75：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为30，将0.3％(按质量计)bacillussubtilisstrainb211的发酵液与物料混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，结果显示，堆制2d后，原料中脂肪含量降低了78.1％。
采用商业化的其他枯草芽孢杆菌按上述步骤堆肥，结果显示，当堆体温度高于35℃时，随着温度升高，菌体活性减弱，堆制2d后，原料中脂肪含量没有明显降低。
实施例3耐高温枯草芽孢杆菌b211菌种活化与培养
将耐高温枯草芽孢杆菌b211接种至营养琼脂培养基平板上，30℃培养25h。营养琼脂培养基的组成为牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g。
将活化好的菌种接种于装有100ml液体培养基的250ml摇瓶中，30℃条件下，450r/min振荡培养25h。摇瓶培养基组成为牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，ph为7.0。
将摇瓶培养液按体积比3％-10％接种至3l发酵罐中，搅拌转速为200-600r/min，通气量为0.8-1.5vvm，溶解氧大于15％，25℃-37℃条件下发酵培养20-40h。发酵罐培养基组成为牛肉膏3.0g，蛋白胨20.0g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2.0g，氯化钠5.0g，ph为7.0。
实施例4含耐高温枯草芽孢杆菌b211的液态复合微生物菌剂的制备
堆肥复合微生物菌剂由耐高温枯草芽孢杆菌b211发酵液与其他菌株发酵液按照不同活菌数配比复配而成，具体制备方法如下：
(1)耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105与嗜热短芽芽孢杆菌b205分别接种至高温灭菌后的营养肉汤培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％-10％(v/v)，培养20-40h；所述耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌b105的培养温度为25-37℃；所述热嗜热短芽芽孢杆菌b205的培养温度为30-60℃；当活菌数大于或等于1×108cfu/ml时，获得所述耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105与嗜热短芽芽孢杆菌b205的发酵液；
(2)深绿木霉的发酵液为将深绿木霉接种至高温灭菌后的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％-10％(v/v)，培养20-30h，培养温度为20-30℃；当活菌数大于或等于1×108cfu/ml时，获得所述深绿木霉的发酵液；
(3)将获得的耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的发酵液按一定比例混合，使耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌数之比为18-28:2-3:0.5-1.5:800-1200:2.8-3.3，添加发酵液质量0.1～10％的市售的载体辅料褐煤、沸石、石粉中的一种或几种，获得包含耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌总数为1.0×109-1.0×1010cfu/ml的液态复合微生物菌剂。
实施例5含耐高温枯草芽孢杆菌b211的固态复合微生物菌剂的制备
将获得的耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的发酵液按一定比例混合，使耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌数之比为18-28:2-3:0.5-1.5:800-1200:2.8-3.3，添加粉碎秸秆、炭化秸秆、麸皮中的一种或几种，热风干燥后，得到包含耐高温枯草芽孢杆菌b211的固态复合微生物菌剂。
实施例6堆肥复合微生物菌剂的应用
将含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按质量比0.5：1：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为30，将含耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌数之比为24:2.4:1:1045:2.9的液态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.3：100的比例混合，菌剂添加量为0.3％，混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体达到最高温度所需时间为21h，最高温度为65℃；堆置2d后，脂肪降解率为93.2％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为16.9，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为88个/g与97.0％。
实施例7堆肥复合微生物菌剂的应用
将含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按质量比0.5：1.1：0.9比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为25，将含耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌数之比为18:2:0.5:800:2.8的液态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.5：100的比例混合，菌剂添加量为0.5％，混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体温度迅速升高，达到最高温度所需时间为26h，最高温度为63℃；堆置2d后，脂肪降解率为88.6％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为17.3，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为90个/g与96.5％。
实施例8堆肥复合微生物菌剂的应用
将含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按质量比0.5：1.1：0.9比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为25，将含耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌数之比为24:2.4:1:1045:2.9的液态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.5：100的比例混合，菌剂添加量为0.5％，混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体温度迅速升高，达到最高温度所需时间为16h，最高温度为66℃；堆置2d后，脂肪降解率为95.7％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为11.2，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为71个/g与98.7％。
实施例8堆肥复合微生物菌剂的应用
将含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按质量比0.5：1.1：0.9比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为25，将含耐高温枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌数之比为28:3:1.5:1200:3.3的固态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.1：100的比例混合，菌剂添加量为0.1％，混合均匀后堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体温度迅速升高，达到最高温度所需时间为32h，最高温度为61℃；堆置2d后，脂肪降解率为81.9％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为18.8，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为93个/g与96.0％。
对比例1
将含油餐厨垃圾、食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按质量比0.5：1：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为30，将不含耐高温枯草芽孢杆菌b211的上述液态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.3：100的比例混合，菌剂添加量为0.3％，其中，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205与深绿木霉的活菌数之比为2.4:1:1045:2.9，混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。
结果表明，堆体达到最高温度所需时间为62h，最高温度为59℃；堆置2d后，脂肪降解率为56.9％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为20.9，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为110个/g与91.8％。
对比例2
具体实施方式同实施例6，区别在于，枯草芽孢杆菌b211、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformisstrain)、地衣芽孢杆菌b105、嗜热短芽芽孢杆菌b205和深绿木霉的活菌数之比有差异，具体如表1所示。结果表明，堆体达到最高温度所需时间延长至57-64h，最高温度为49-58℃；堆置2天后，脂肪降解率为58.2％-77.7％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为18.9-24.6，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为230-890个/g、56.8％-88.0％。
表1
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。