LINC00266-1RNA作为实体瘤标志物的应用的制作方法

本发明涉及癌症的诊断和治疗领域，具体而言，涉及linc00266-1rna作为实体瘤标志物的应用。

背景技术：

癌症是世界上第二大死亡原因，每年造成约880万人死亡。从全球范围来看，近六分之一的死亡是由于癌症引起的。近年来，随着人们物质生活水平的提高，生活节奏加快、饮食结构的改变，人口老龄化的加剧，环境污染等原因导致实体恶性肿瘤发病率逐年攀升，并且呈现出年轻化的趋势。

虽然早期实体恶性肿瘤患者的5年生存率多可达80％以上，但是因为早期实体恶性肿瘤无特异性的症状和体征，病人就诊率低下。加上缺乏便利、有效的普查手段及缺乏敏感度高、特异度强的筛查方法，仅有不到30％的实体恶性肿瘤患者在早期得到确证。大多数患者就诊时，其疾病已经进入进展期，有的甚至发生了远处转移，严重缩短患者的存活时间，影响患者生活质量。虽然近年来随着实体恶性肿瘤诊疗技术的不断发展，新药物、新治疗技术的出现，使得实体恶性肿瘤患者的预后有了很大的改善，但晚期癌症患者的预后仍然不尽如意。临床治疗常常因实体恶性肿瘤发生了复发或远处转移而宣告失败。缺乏有效的肿瘤监测指标是重要原因。因此，当前鉴定能用于提示实体恶性肿瘤转移、复发倾向的新标记物，将有助于临床上评估实体恶性肿瘤患者术后复发率及预后，为手术切除后是否需要进一步的联合辅助治疗提供判断依据。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明涉及linc00266-1rna的检测剂在制备用于肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中增加的linc00266-1rna的表达量是实体瘤的指征和/或实体瘤预后不良的指征。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于检测linc00266-1rna表达水平的试剂盒，其包括seqidno：1和2所示的引物。

根据本发明的一方面，本发明还涉及linc00266-1rna的sirna，其核苷酸序列分别如seqidno：7或9所示。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：

在本发明之前，还没有出现涉及本发明linc00266-1rna用于实体恶性肿瘤预后评估及诊断的公开报道。临床研究证实，linc00266-1rna在实体恶性肿瘤组织中高表达与实体恶性肿瘤患者预后差呈正相关。癌组织中linc00266-1rna高水平的患者具有更短的生存期和更高的死亡率。据此，linc00266-1rna作为生物标志物有效的提高了临床中使用试剂盒进行实体恶性肿瘤预后判断的阳性率。

综上所述，本发明具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为本发明实施例1中rt-pcr检测胃癌及肝癌组织中linc00266-1表达rt-pcr结果对比图；

图2为本发明实施例2中rt-pcr检测胃癌及肝癌组织中linc00266-1表达q-pcr结果对比图；

图3为为本发明实施例3中沉默linc00266-1的结肠癌细胞株sw-620表达linc00266-1的rt-pcr结果对比图；

图4为本发明实施例3中沉默linc00266-1的结肠癌细胞株sw-620表达linc00266-1的q-pcr结果对比图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明涉及linc00266-1rna的检测剂在制备用于肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中增加的linc00266-1rna的表达量是实体瘤的指征和/或实体瘤预后不良的指征。

长链非编码rna(longnon-proteincodingrna，lncrna)起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，实际上lncrna以rna的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控了基因的表达水平。然而近年来的研究表明，某些的序列中包含的一小段却看上去好像一个编码区域，也能编码一些蛋白(amicropeptideencodedbyaputativelongnoncodingrnaregulatesmuscleperformance，douglasm.etal，cell，2015)。即便如此，现有技术仍普遍认为绝大多数lncrna不会编码任何蛋白质。

长链基因间非编码rna(longintergenicnon-proteincodingrna，lincrna)是lncrna中的一种，linc00266-1(geneid：140849)是最近新发现的一种lincrna，其功能还未探究清楚。本发明发现linc00266-1rna与肿瘤特别是实体瘤相关，且linc00266-1rna能够表达蛋白多肽。

上述，需要理解的是，本发明提供一种用于实体恶性肿瘤预后评估判断的新标记物：linc00266-1rna。经过临床研究证实，其在实体恶性肿瘤组织中高表达与实体恶性肿瘤患者预后差呈明显正相关。癌组织中linc00266-1rna高水平的患者具有更短的生存期和更高的死亡率。据此，linc00266-1rna作为生物标志物有效的提高了临床中使用试剂盒进行实体恶性肿瘤预后判断的阳性率。

在一些实施方式中，所述肿瘤为实体瘤。

在一些实施方式中，所述试剂或试剂盒用于检测受试者肿瘤组织或癌旁组织的细胞裂解物。

本文使用的″组织裂解物″、″细胞裂解物″、″裂解物″、″裂解的样品″、″组织提取物″或″细胞提取物″表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语″裂解″包括。

在一些实施方式中，所述实体瘤/癌选自胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、头颈部癌、黑素瘤、神经内分泌癌、cns癌、脑肿瘤、骨癌和软组织肉瘤。

在一些实施方式中，所述实体瘤选自晚期或转移性恶性实体瘤。

术语“晚期或转移性恶性实体瘤”是指组织学或细胞学上所证实诊断的晚期、不可切除和/或转移性复发或难治性恶性实体瘤，其对标准疗法无效或不存在经证明对其有效的疗法。根据本发明，恶性实体瘤包括但不限于癌、肉瘤、黑素瘤及淋巴瘤。

rna的检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该rna杂交，且标记有荧光标记的核酸等。

在一些具体的实施方式中，所述linc00266-1rna的检测剂选自qrt-pcr/rt-pcr的引物。

qrt-pcr的引物可方便地对linc00266-1rna进行检测，以衡量linc00266-1rna的转录水平。

在一些实施方式中，所述qrt-pcr的引物的上游引物如seqidno：1所示，下游引物如seqidno：2所示。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于检测linc00266-1rna表达水平的试剂盒，其包括seqidno：1和2所示的引物。

所述试剂盒可以对linc00266-1rna反转录的cdna进行扩增。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括反转录试剂、内参引物、用于指示dna合成量的荧光物质、qpcr反应缓冲液、dntps、dna聚合酶、水中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述dna聚合酶选自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶、klenow片段；

在一些实施方式中，所述指示剂选自sybr(例如sybrgreeni)、evagreen、picogreen、pekogreen。

在一些实施方式中，所述内参引物选自gapdh的引物，其上游序列和下游序列分别如seqidno：5和6所示。

根据本发明的一方面，本发明还涉及linc00266-1rna的sirna，其核苷酸序列分别如seqidno：7或9所示。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种评估肿瘤，例如实体瘤的方法，所述方法包括：

(a)使用如上所述的特异性地测量linc00266-1rna所需的试剂测量样品中的linc00266-1rna的表达量，(b)任选地，测量样品中的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的linc00266-1rna的表达量是癌症的指征。

诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。相反地，可使用生化标志物(例如，cyfra21-1、cea、ca15-3、ca19-9、erbb-2或本文证实的linc00266-1rna)来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。

在一些实施方式中，所述方法用于肿瘤，例如实体瘤诊断和/或预后评估。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

rt-pcr反应检测linc00266-1基因在胃癌及肝癌组织中的表达。

具体实验方案如下：

1.rna提取

1)组织处理：取10mg左右组织加入1mltrizol，用匀浆机匀浆；离心15min，12000g，取上清。

2)向上清中加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀3sec，静置3min。

3)4℃，12000g离心15min，此时可见裂解液分三层：上层为水相含有rna；中层为dna，脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。

4)取上清到新的ep管内；加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min后，4℃，12000g离心10min。

5)小心去掉上清，注意不要丢失rna沉淀，加入1ml75％乙醇，上下颠倒，使沉淀块重悬起。

6)4℃，12000g离心10min，小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失rna沉淀，若沉淀松动可再次离心。晾干约15min，至管壁无液体。

7)加入适量体积(20-30ul)的depc水溶解rna，58℃水浴10分钟。

8)取出2ul定量，测量buffer：10mmtriscl(ph7.8)，根据定量结果进行逆转录。(1a260＝40μg/ml，a260/a280＝1.8～2.1)。

2.cdna逆转录

实验体系

m-mlvreversetranscriptase：

3.引物(扩增cdna)：使用的引物如下所列：

4.rt-pcr：以gapdh作为内参。rt-pcr的反应体系：每个反应管中分别加入2μl10×buffer，分别加入2μldntp，1μl正向引物，1μl反向引物，1μlcdna模板，0.2μltaq酶，加水至20μl。pcr反应条件如下：95℃，5分钟预变性；95℃，30秒变性；59℃，30秒退火72℃，20秒延伸；28个循环，琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，结果见图1。

实施例2

q-pcr反应检测linc00266-1基因在胃癌及肝癌组织中的表达。

q-pcr：以gapdh作为内参。q-pcr的反应体系：每个反应管中分别加入10μlpremixextaqtmiibuffer(2×)，0.8μl正向引物，0.8μl反向引物，2μl实施例1中制得的cdna模板，0.4μlroxreferencedye(50×)，0.2μltaq酶，加水至20μl。q-pcr反应条件如下：

①95℃10min

②95℃15s

③62℃1min

④72℃20s

⑤goto②③④for40个循环

使用的引物如下所列：

实时荧光定量pcr结果在bio-radcfxmanager系统软件分析，根据仪器给出的荧光信号增长曲线及其反应临界循环数(cyclethreshold，ct)来观察扩增结果。采用2-δδct值公式法比较样品间荧光定量结果，首先计算出处理组的目的基因δct值与对照组的相应基因δct值之差，然后用2^-δδct来表示干扰组的目的基因相对于对照组的基因的表达水平。平行实验重复3次。结果见图2。

实施例3

rt-pcr反应检测sirna沉默linc00266-1基因的效果

(1)将细胞消化成单细胞悬液，计数，以5×10⁵个/孔的浓度接种至6孔板中，37℃、5％co2培养箱中培养过夜。

(2)用rnase-free的去离子水溶解sialkbh1至终浓度为20μm，取5μl溶于500μlopti-mem中，混匀、静置。

其中，相关sirna序列如下：

silinc00266-1#1-sense：

5′-cguuucaccugcaguugaatt-3′(seqidno：7)

silinc00266-1#1-anti-sense：

5′-uucaacugcaggugaaacgtt-3’(seqidno：8)；

silinc00266-1#2-sense：

5′-cguuucaccugcaguugaatt-3′(seqidno：9)，

silinc00266-1#2-anti-sense：

5′-uucaacugcaggugaaacgtt-3′(seqidno：10)；

negativecontrolsirna-sense：

5′-gcacaagcuggaguacaacuacatt-3′(seqidno：11)，

negativecontrolsirna-anti-sense：

5′-uguaguuguacuccagcuugugctt-3′(seqidno：12)

其中最后两位tt的为脱氧核糖核苷酸悬头。

(3)将3μlimax转染试剂溶于500μlopti-mem中，轻轻混匀，室温静置5min。

(4)将2跟3的两管混匀，室温静置20min，滴加至6孔板孔中，混匀，37℃、5％co2培养箱中培养。

(5)6小时后，吸去转染培养基，加入2ml完全培养基，继续培养。

(6)48小时后，提取细胞rna，并逆转录成cdna，采用rt-pcr检测linc00266-1的表达情况。

结果见图3，转染使细胞沉默linc00266-1有效。

q-pcr反应检测sirna沉默linc00266-1基因的效果，反应条件通实施例2，结果如图4所示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。