一种米曲霉ZA151及其应用的制作方法

本发明属于工业微生物
技术领域：
，尤其涉及一株适用于蚝汁生产用的米曲霉(aspergillusoryzae)，本发明还涉及所述米曲霉在蚝汁生产中的应用。
背景技术：
：牡蛎(蚝)是世界第一大养殖贝类，其肉味鲜美，含有丰富的糖原、蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素等营养成分。牡蛎中氨基酸组成完善，据世界粮农组织评定，牡蛎肉中必需氨基酸完全程度和质量优于牛乳和人乳。中华人民共和国卫生部第一批颁发68种药食两用的食品就有牡蛎。蚝汁是以牡蛎为原料经蒸煮后浓缩加盐制成的产品。然而，由于牡蛎主要以水中的浮游生物和藻类为食，这些藻类在代谢过程中产生的带有腥味的废物，逐渐在体内积累从而使得牡蛎具有一定的腥臭味。如其他水产品一样，牡蛎(包括水解产物)都存在着不同程度的腥臭味。这些腥臭味会影响原蚝汁的风味进而影响蚝汁的品质，因此去除原蚝汁(牡蛎汁)的腥臭味至关重要。专利号为01130182.1的中国专利申请公开了一种牡蛎口服液的制备方法，里面涉及到去除牡蛎腥臭味：①取新鲜牡蛎软体加水匀浆，并以适量的木瓜蛋白酶水解，木瓜蛋白酶能有效地清除腥味蛋白的腥味；②牡蛎匀浆经过酶解后，进行加糖及加热处理，以减少碱性物质腥臭味；③进一步进行加酸及加热处理，以进一步清除碱性物质的腥臭味。此方法虽然可以在一定程度上去除牡蛎汁的腥臭味，但是此方法步骤多，程序较繁琐，成本较高，工作量大，加酸及加热会破坏牡蛎的营养成分。专利号为201210185818.6的中国专利申请公开了一种生蚝水解蛋白粉和蚝油的生产方法，里面涉及到去除牡蛎腥臭味：往蚝肉加入含酸量0.1％～0.8％的酸性水溶液或含碱量0.1％～0.6％碱性水溶液，在低温条件下搅拌捞取表面脂肪油；加入水解酶在40℃～80℃下搅拌水解，灭酶，加入活性炭脱色除臭，蝶式离心机分离沉淀物、水解蛋白液、脂肪油；通过大孔树脂柱吸附净化水解蛋白液，又能进一步清除脂肪油。酸碱法脱腥，在处理过程中会有部分酸碱残留，去除困难，对食品的健康安全会产生一定影响，而且会产生一定量的废水，不利于环保。活性炭结构稳定，吸附能力强，但其只能吸附水产品表面的腥味物质，而大孔树脂成本较高，因而都不适于牡蛎肉的脱腥，而且会造成一定的营养成分的损失。专利号为200910037535.5的中国专利申请公开了一种牡蛎氨基酸功能饮料的生产方法，里面涉及到去除牡蛎腥臭味：牡蛎取软体部打成浆状，加适量水及提取溶剂油-乙酸乙酯混合液搅拌除腥味，离心取水溶液及沉淀搅拌均匀，加盐酸水解得混合氨基酸水溶液后加6号轻汽油搅拌再除腥味，离心收集混合氨基酸水溶液，真空浓缩得混合氨基酸浓缩液。此方法中提取溶剂油-乙酸乙酯混合液、盐酸、6号轻汽油会有部分溶剂残留，去除困难，会影响食品的健康安全。专利号为201210254021.7的中国专利申请公开了一种牡蛎方便食品的制备方法，里面涉及到去除牡蛎腥臭味：牡蛎在沸水中烫煮1～5分钟，捞出后在盐水、糖水或柠檬酸中浸泡30～120分钟，在浸泡液中加入数滴料酒、白醋或姜汁进行脱腥处理。牡蛎打浆后按比例加入牡蛎烫煮液，加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶进行酶解，离心机离心，取酶解上清液旋转蒸发浓缩即得牡蛎酶解产物。酶解产物中加入酵母、β-环状糊精或活性炭，在40～60℃下恒温30～120分钟后离心15分钟，去除沉淀得脱腥后酶解产物。调节脱腥后酶解产物的ph为4～8，然后加入还原糖，在100℃条件下反应10～50分钟，得美拉德反应产物。此方法步骤多，程序较繁琐，成本较高，工作量大。β-环糊精不能包埋大分子物质而活性炭只能吸附水产品表面的腥味物质，因此用β-环糊精和活性碳不能完全脱除色素和腥臭味。美拉德反应后会损失部分氨基酸，由于焦糖物质的产生，一些苦味氨基酸也增加了，而且美拉德反应很难人为控制。专利号为200610033813.6的中国专利申请公开了一种生产海鲜风味调味料的生产工艺，其工艺步骤如下：(1)取海鲜下脚料按1比1的比例与水混合破碎匀浆，煮沸、冷却、调ph值；(2)加入相当于海鲜下脚料与水总重量1～30％的枯草芽孢杆菌培养液，保持温度、水解、煮沸、冷却、调ph值；(3)加入相当于海鲜下脚料与水总重量1～30％的米曲霉培养液，保持温度、水解、煮沸，得到水解产物；(4)水解产物初分离得海鲜风味调味料原液；(5)对海鲜风味调味液原液进行脱腥、稳定及包装得海鲜风味调味料成品。该方法中枯草芽孢杆菌培养液和米曲霉培养液所含酶系在一定程度上可以降低鱼蛋白酶解产物的腥味，但是由于酶活偏低导致去腥效果并不好，所以后续仍需要离心脱去油脂和真空脱腥，程序复杂，成本较高。专利号为201210104340.x的中国专利申请公开了一种龙须菜海藻酱的制作方法，经过蒸煮、均质、发酵、调味与炒制后经真空包装和杀菌处理，获得不同口味的龙须菜海藻酱，本发明方法采用米曲霉和鲁氏酵母菌对龙须菜进行发酵处理，利用它们的协同发酵作用，经过微生物发酵可以很好地去除龙须菜本身固有的藻腥味。该方法中龙须菜脱腥主要是通过前期高温蒸煮再加入玉米淀粉、大豆脱脂粕制成龙须菜发酵粕，然后将米曲霉和鲁氏酵母菌种曲分别接种在龙须菜发酵粕上发酵去腥，发酵时间长达6天，因此去腥反应时间太久，效率太低。专利号为201510936442.1的中国专利申请公开了一种脱腥牡蛎酶解汁的制备方法，该方法是在牡蛎酶解后期加入酵母粉酵解进行脱腥处理，酶解完成后，灭酶、过滤、杀菌、分袋包装或将酶解液进行喷雾干燥或真空冷冻干燥成粉，包装即可。酵母粉虽然可以在一定程度上去除牡蛎腥味，但是酵母粉自身也有味道且对温度非常敏感，容易失活。专利号为201710617059.9的中国专利申请公开了一种甜汁蚝油的制备工艺，其特征在于包括如下步骤：(1)蒸面、(2)接种、(3)制曲、(4)发酵、(5)压滤和(6)精制灭菌包装。把北方甜面酱的生产和蚝油生产结合起来，生产出一种具有酱香风味的鲜甜蚝油。该方法将浓缩蚝汁加入面酱中通过米曲霉自然发酵可以去除蚝汁的腥味，但是自然发酵周期长达20天，时间太久，效率太低。环状糊精对牡蛎蛋白水解液的脱腥效果不佳，是由于蛋白水解液中腥味分子太大，环状糊精无法将其包埋。活性炭结构稳定，吸附能力强，但其只能吸附水产品表面的腥味物质，而大孔树脂成本较高，因而都不适于牡蛎肉的脱腥，而且会造成一定的营养成分的损失。酸碱法脱腥，在处理过程中会有部分酸碱残留，去除困难，对食品的健康安全会产生一定影响，而且会产生一定量的废水，不利于环保。有机溶剂去腥，也会产生溶剂残留这一问题。利用美拉德反应脱腥后会损失部分氨基酸，由于焦糖物质的产生，一些苦味氨基酸也增加了，而且美拉德反应很难人为控制。现有的枯草芽孢杆菌培养液和米曲霉培养液所含酶系在一定程度上可以降低鱼蛋白酶解产物的腥味，但是去腥效果并不好，后续仍需要离心脱去油脂和真空脱腥，程序复杂，成本较高。现有的米曲霉和鲁氏酵母菌脱腥效果有限且去腥反应时间太久，效率太低。酵母粉虽然可以在一定程度上去除牡蛎腥味，但是酵母粉自身也有味道且对温度非常敏感，容易失活。技术实现要素：本发明提供一株米曲霉新菌种za151，它能够降解原蚝汁中的腥味物质，具有分泌胞外多糖的特征，分泌的胞外多糖能够增强蚝汁的黏稠性，改善蚝汁的滋味和体态，本发明还提供了该米曲霉新菌种的应用。为实现上述目的，所采取的技术方案：一种米曲霉za151，所述米曲霉za151保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60472。本发明的米曲霉za151菌株是以米曲霉as3.951为出发菌株，经诱变选育获得。本发明提供的米曲霉za151于2018年11月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为gdmccno：60472。通过实施例证明该菌株具有遗传性能稳定，易于扩大培养；该菌株能够降解原蚝汁中的腥味物质，同时分泌的胞外多糖能够增强蚝汁的黏稠性，改善蚝汁的滋味和体态。本发明米曲霉菌株(aspergillusoryzae)za151适用于大规模工业化生产蚝汁使用，应用前景广阔。本发明的米曲霉za151的菌落特征如下：豆汁平板培养基培养72h，菌落直径达32mm，质地绒状、菌落较厚、菌丝生长旺盛，孢子细密、较多、色泽黄绿色。菌落背面浅褐色，无水溶性色素。未见有性孢子。本发明提供了一种发酵液，所述发酵液是采用上述所述的米曲霉za151进行液体培养后得到的。优选地，所述液体培养所用的培养基包括以下重量份的组分：玉米芯25～35重量份，大豆蛋白胨4～6重量份，磷酸二氢钾4～6重量份，七水硫酸镁0.4～0.6重量份，氯化钙0.4～0.6重量份，自来水950～1050重量份；优选地，所述液体培养的温度为29～33℃，培养时间为70～74小时。本发明提供了一种发酵上清液，其特征在于，所述发酵上清液是将上述所述的发酵液中的菌丝体去除后得到的上清液。本发明提供了一种腥味减少的蚝汁，其特征在于，所述蚝汁是将上述所述的发酵液或上述所述的发酵上清液和原蚝汁混合后得到的。优选地，上述所述的发酵液或上述所述的发酵上清液和原蚝汁的体积比为1:10～3:10。本发明提供了上述所述的米曲霉za151、上述所述的发酵液或上述所述的发酵上清液在去除或减少带有腥味的食品或者调味品的腥味中的应用。优选地，所述带有腥味的调味品为蚝汁。本发明提供了上述所述的米曲霉za151、上述所述的发酵液或上述所述的发酵上清液在制备蚝汁中的应用。有益效果：本发明米曲霉za151菌株的筛选方法具有普适性，可以广泛应用于丝状真菌的改造。本发明提供的米曲霉za151具有遗传性能稳定，易于扩大培养的优点；具有降解原蚝汁中腥味物质的优点；具有分泌胞外多糖的优点。本发明采用提供的筛选方法来改良现用菌株，有效筛选到一株优良米曲霉菌株za151；将该菌株应用于蚝汁生产，能有效去除原蚝汁的腥臭味，提高蚝汁的风味口感；同时该菌株分泌的胞外多糖能够增强蚝汁的黏稠性，改善蚝汁的滋味和体态，从而增加蚝汁的销量，提高企业经济效益。附图说明图1为本发明米曲霉za151的筛选流程图。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1米曲霉za151的诱变获得，具体流程如图1所示。1、菌种诱变取as3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行artp诱变。用0.85％的无菌生理盐水将诱变后的孢子悬液逐级稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度，制成孢子稀释液。取0.2ml孢子稀释液涂布于选择培养基平板，31℃避光培养96h。培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长情况、透明圈形成的快慢及透明圈大小、菌落直径大小等。挑选与出发菌种as3.951相比具有菌丝生长正常、透明圈大、菌落直径大特点的菌落。挑选满足选择培养基平板筛选条件的突变菌株转接pda斜面，培养成熟后进行菌种保藏。编号依次为mc101、mc102、mc103、mc104、mc105、mc106。上述选择培养基的配方为：称取6g干酪素，0.36g磷酸二氢钾，0.58g磷酸氢二钠，0.244g硫酸镁，20g琼脂粉，溶于500ml蒸馏水中，再加入500ml原蚝汁，ph自然，分装，121℃灭菌20min。其中原蚝汁的配方为：500g牡蛎肉加少量水打浆，用一层纱布过滤，滤液加水定容至1000ml。2、诱变菌株筛选(1)、诱变菌株的初筛将上述诱变获得的6株目标菌种及出发菌种as3.951活化转接于试管斜面pda培养基上，31℃培养5天。取成熟斜面接种于三角瓶发酵培养基中发酵，控制发酵温度为31℃，搅拌转速为150r/min，发酵时间为72h，观察米曲霉生长情况。发酵结束后，取样测定菌丝体生物量，同时按体积比(v米：v牡＝1:10)将发酵液加入原蚝汁中，搅拌均匀，2小时后利用腥味感官评定方法来评定菌株去腥效果。检测6株目标菌种及原始菌种as3.951的菌丝体生物量以及腥味感官值，检测结果见表1。上述三角瓶发酵培养基的配方为：玉米芯30g，大豆蛋白胨5g，磷酸二氢钾5g，七水硫酸镁0.5g，氯化钙0.5g，自来水1000ml。121℃灭菌30min。其中原蚝汁的配方为：500g牡蛎肉加少量水打浆，用一层纱布过滤，滤液加水定容至1000ml。上述菌丝体生物量测定方法：菌株发酵结束后，取1l发酵液用200目滤布过滤，将所得菌丝体放在烘箱中烘干，控制烘箱温度为70℃，烘烤时间为12h。得到干燥菌丝体，称量其质量为w，则菌丝体生物量为wg/l。上述腥味感官评定方法：腥味感官评定由6名感官评定员组成，采用先闻后尝的方式，分别给试验样品的腥气味评分。6名感官评定员(3男3女)，23-30岁之间，系统学习过感官评定课程，有丰富的感官评定经验。评分原则，以去离子水为对照(分值为0分)，分值越大，则腥味越重，最高分为7分。即0-无腥味；1-略有腥味；2-腥味较弱；3-腥味弱；4-腥味一般；5-腥味偏重；6-腥味较重；7-腥味极重。取平均值为最后得分。表1菌种菌丝体生物量及腥味感官值优选菌丝体生物量高和去腥效果好的菌株mc101、mc103、mc105进行复筛。(2)、诱变菌株的复筛将上述初筛选出的3株菌mc101、mc103、mc105及出发菌种as3.951活化转接于试管斜面pda培养基上，31℃培养5天。活化后转接三角瓶pdy培养基中培养，控制培养温度为31℃，搅拌转速为150r/min，培养时间为48h。再将培养好的液体菌种接种于发酵罐发酵培养基中进行发酵，控制发酵温度为31℃，搅拌转速为150r/min，通气比为1vvm，发酵ph为6.0，发酵时间为72h，观察米曲霉生长情况。发酵结束后，取样测定菌丝体生物量，同时按体积比(v米：v牡＝1:10)将发酵液加入原蚝汁中，搅拌均匀，2小时后利用腥味感官评定方法来评定菌株去腥效果。检测3株目标菌种及原始菌种as3.951的菌丝体生物量以及腥味感官值，检测结果见表2。上述发酵罐发酵培养基的配方为：玉米芯30g，大豆蛋白胨5g，磷酸二氢钾5g，七水硫酸镁0.5g，氯化钙0.5g，自来水1000ml。121℃灭菌30min。其中原蚝汁的配方为：500g牡蛎肉加少量水打浆，用一层纱布过滤，滤液加水定容至1000ml。上述菌丝体生物量测定方法：菌株发酵结束后，取1l发酵液用200目滤布过滤，将所得菌丝体放在烘箱中烘干，控制烘箱温度为70℃，烘烤时间为12h。得到干燥菌丝体，称量其质量为w，则菌丝体生物量为wg/l。上述腥味感官评定方法：腥味感官评定由6名感官评定员组成，采用先闻后尝的方式，分别给试验样品的腥气味评分。6名感官评定员(3男3女)，23-30岁之间，系统学习过感官评定课程，有丰富的感官评定经验。评分原则，以去离子水为对照(分值为0分)，分值越大，则腥味越重，最高分为7分。即0-无腥味；1-略有腥味；2-腥味较弱；3-腥味弱；4-腥味一般；5-腥味偏重；6-腥味较重；7-腥味极重。取平均值为最后得分。表2菌种菌丝体生物量及腥味感官值优选菌丝体生物量最高和去腥效果最好的菌株mc101进行菌株保藏。本实施例选育获得的mc101已经由本发明人保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为米曲霉(aspergillusoryzae)za151，保藏号为gdmccno：60472。因此，在本申请中，mc101与za151是指同一菌株。实施例2米曲霉za151菌株遗传稳定性检测将米曲霉菌株za151经pda斜面培养基连续传代10代，观察各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面种按照实施例1所述方法在发酵罐中发酵，发酵结束后用发酵液对原蚝汁进行去腥，测定其菌丝体生物量以及腥味感官值。判断其遗传稳定性，具体数据见表3。表3米曲霉菌株za151传代稳定性检测结果如表3的结果所示，从菌丝体生物量和腥味感官值检测结果来看，米曲霉菌株za151的遗传稳定性良好。上述菌丝体生物量测定方法：同实施例1。上述腥味感官评定方法：同实施例1。实施例3米曲霉za151菌株在蚝汁生产中的应用效果将诱变筛选获得的米曲霉菌株za151按照实施例1所述方法在发酵罐中发酵，发酵结束后获得发酵液。将鲜蚝清洗后去壳取肉，按水与蚝肉质量比0.3：1加水，加热，再对原蚝汁进行浓缩，最终控制原蚝汁中固形物含量为20％，并用120目过滤网过滤，除去杂质。将所得原蚝汁均匀分为两部分。1、将一部分原蚝汁导入调配池中，然后按体积比(v米：v蚝＝1:10)将米曲霉za151发酵液加入调配池中，进行充分搅拌，让原蚝汁与米曲霉za151发酵液调配均匀，2小时后采用夹层锅浓缩方法对混合原蚝汁进行浓缩，最终控制原蚝汁中固形物含量为25％，加入适量食盐，即得成品蚝汁a。2、将另一部分原蚝汁直接采用夹层锅浓缩方法进行浓缩，最终控制原蚝汁中固形物含量为25％，加入适量食盐，即得成品蚝汁b。评定蚝汁a和蚝汁b的腥味感官值，并对两种蚝汁的色泽、气味、滋味、体态进行感官鉴评。具体结果见表4。表4蚝汁a和蚝汁b的腥味感官值及其它感官鉴评结果蚝汁腥味感官值色泽气味滋味体态蚝汁a0.504.084.303.654.10蚝汁b2.673.503.253.153.51上述腥味感官评定方法：同实施例1。上述色泽、气味、滋味、体态四项感官指标评定方法：由6名感官评定员组成，采用先闻后尝的方式，分别给试验样品的色泽、气味、滋味、体态评分。6名感官评定员(3男3女)，23-30岁之间，系统学习过感官评定课程，有丰富的感官评定经验。评分原则，各单项指标评分分值为1～5分，分数越高，该项指标越好。取平均值为最后得分。由表4可知，米曲霉za151发酵液能够有效去除原蚝汁的腥臭味，全面提高成品蚝汁的色泽、气味、滋味、体态等感官要求。用苯酚-硫酸法测定蚝汁a和蚝汁b的多糖含量，同时测定蚝汁a和蚝汁b的氨基酸态氮、总酸、食用盐、无盐固形物的含量。具体结果见表5。表5蚝汁a和蚝汁b的多糖、理化指标检测结果项目名称多糖氨基酸态氮总酸(以乳酸计)食用盐(以nacl计)无盐固形物单位(g/l)(g/100g)(g/100g)(g/100g)(g/100g)蚝汁a4.15≥0.35≤1.20≤20.00≥10.00蚝汁b2.07≥0.35≤1.20≤20.00≥10.00由表5可知，米曲霉za151发酵液能够提高成品蚝汁中的多糖含量，氨基酸态氮、总酸、食用盐、无盐固形物的含量也符合蚝汁国内行业标准《sb/t11191—2017》的要求。因此本发明米曲霉菌株(aspergillusoryzae)za151能够有效去除原蚝汁的腥臭味，全面提高成品蚝汁的色泽、气味、滋味、体态等感官要求，提高成品蚝汁中的多糖含量。适用于大规模工业化生产蚝汁使用，应用前景广阔。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12