锌指蛋白ZNF146的用途的制作方法

本发明涉及肿瘤抑制技术领域，尤其是锌指蛋白znf146在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的用途。

背景技术：

鼻咽癌是我国南方高发的恶性肿瘤，主要治疗手段是放疗和化疗。但是放化疗尤其是放疗存在着严重的头颈部并发症，主要包括长年的口干、牙齿松动、耳鸣、消瘦和体质虚弱等；晚期远处转移病人仍然缺乏有效的治疗手段^[1]。因此，阐明鼻咽癌进展的分子机制，为发展新的治疗手段和策略提供理论依据，具有重要意义。

转录因子在调节基因表达过程中发挥关键作用，其异常是癌症发生发展的主要原因之一，因此也是癌症诊治靶标的研究热点^[2]。目前已报道的鼻咽癌相关转录因子包括：1)功能激活或者上调的转录因子：myc^[3]、hif1a^[4]、ezh2^[5]、cops5^[6]、twist1^[7]、bmi1^[8]、epas1^[9]、snai1^[10]和parp1^[11]；2)功能抑制或者下调的转录因子：pml^[12]、nrf1^[13]、pawr^[14]、fezf2^[15]、atoh8^[16]、hoxc8^[17]、prdm2^[18]、rarb^[19]和hopx^[10]等。这些转录因子的功能涉及鼻咽癌的增殖、干性、转移和治疗耐受等特性，因此成为鼻咽癌诊治研究的靶标。

转录因子znf146是一个33kda的kruppel蛋白，结构上仅由10个重复的锌指结构域(motif)组成^[20](图1)，在人的各种组织中普遍高表达^[21](http://www.proteinatlas.org)，表现出“看家基因”的特性。转基因小鼠显示，乳腺特异性表达znf146导致乳腺发育迟滞^[22]，表现出“生长抑制”的特性。除了转录因子活性以外，已知znf146与端粒蛋白hrap1^[20]和泛素连接酶ubc9^[23]存在相互作用。目前，znf146调控的下游靶基因以及上游调控其表达的基因未见报道。总之，目前znf146的功能还知之甚少。

常见抑瘤基因(如tp53和rb1等)在鼻咽癌中鲜有发生突变^[24]。目前，已报道的鼻咽癌相关抑瘤基因(如cdkn2a/b、rassf1、thy1、cadm1、dlc1、ptprg、sox1和dab2等)大多由于启动子甲基化导致表达下调或缺失，从而失去抑瘤作用^[24]。最近，南方医科大学李欣教授课题组也发现，启动子甲基化是抑瘤基因pten在鼻咽癌表达下调的原因之一^[25]。为全面探究鼻咽癌的甲基化图谱，中山大学马骏教授课题组开展了鼻咽癌全基因组的甲基化分析^[26]，发现2173个cpg岛在鼻咽癌特异甲基化；同时他们发现转录因子hopx的启动子甲基化介导鼻咽癌的远处转移^[10]。但是，在他们发现的2173个鼻咽癌特异甲基化cpg岛中，没有znf146的cpg岛；可能的原因是，他们所用的illumina450kbeadchip中，有关znf146cpg岛的探针在鼻咽癌中没有检测到信号。

技术实现要素：

基于上述问题，本申请的发明人在研究znf146功能的过程中发现，znf146在鼻咽癌组织中表达量比鼻咽非癌组织下调，基于此发现，进行了相关的研究探索。

基于上述研究的结果，本发明提供了以下技术方案：

在第一个方面，本发明提供了锌指蛋白znf146在制备鼻咽癌诊断试剂盒中的应用。根据本申请的发明人的发现，在鼻咽癌组织中锌指蛋白znf146的表达量显著低于鼻咽非癌组织中znf146的表达量，由此，通过检测同一个患者鼻咽癌组织以及鼻咽非癌组织中znf146的表达量，可以为鼻咽癌诊断提供重要的依据。

在第二个方面，本发明提供了一种鼻咽癌诊断试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测细胞或组织中锌指蛋白znf146的表达量或znf146mrna含量的试剂。其中，检测锌指蛋白znf146的表达量的试剂优选为znf146的抗体；检测znf146mrna含量的试剂优选用于荧光定量pcr的znf146mrna的扩增引物。

在第三个方面，本发明提供了锌指蛋白znf146在制备或筛选抗鼻咽癌的药物中的应用。根据发明人的发现，沉默znf146促进鼻咽癌细胞体外增殖和增加干性，说明正常的鼻咽非癌细胞中znf146锌指蛋白具有一定的表达水平，由此可知，通过提高细胞或组织中锌指蛋白znf146表达量或znf146mrna含量可以抑制鼻咽癌细胞的增殖和干性，进而起到抗鼻咽癌的效果。

在第四个方面，本发明提供了能够提高细胞或组织中锌指蛋白znf146表达量或znf146mrna含量的试剂在制备抗鼻咽癌的药物中的应用。

在第五个方面，本发明提供了znf146基因启动子的去甲基化药物在制备或筛选抗鼻咽癌的药物中的应用。根据发明人的发现，znf146基因启动子的去甲基化后，在鼻咽癌细胞中znf146mrna含量显著提高，基于上述第三个方面的分析，znf146基因启动子的去甲基化试剂具有抗鼻咽癌的效果。

优选地，所述去甲基化药物为5-杂氮-2-脱氧胞苷。

在第六个方面，本发明提供了一种抗鼻咽癌的药物，所述药物中含有能够提高细胞或组织中锌指蛋白znf146表达量或znf146mrna含量的试剂。

优选地，所述药物中含有znf146基因启动子的去甲基化药物。

优选地，所述去甲基化药物为5-杂氮-2-脱氧胞苷。

综上所述，本发明的有益效果为：

本申请的发明人在研究znf146功能的过程中发现，znf146在鼻咽癌组织中表达量比鼻咽非癌组织下调；沉默znf146促进鼻咽癌细胞体外增殖和增加干性；znf146基因启动子的去甲基化后，在鼻咽癌细胞中znf146mrna含量显著提高，为鼻咽癌的诊断提供了有力的依据，并为鼻咽癌的治疗提供了新的思路和有效的药物。

附图说明

图1为锌指蛋白znf146的结构域示意图；其中，znf146由292个氨基酸组成，包含10个重复的锌指c2h2样结构域；

图2基于102例鼻咽癌和慢性鼻咽炎基因芯片的表达谱聚类结果图，其中，蓝色条带对应一型非角化性鼻咽癌，绿色条带对应慢性鼻咽炎，橙色条带对应二型非角化性鼻咽癌；

图3是五个二型非角化性npc主要调节因子的相互调控关系图；

图4是五个主要调节因子调控635个二型非角化性npc的上调基因的关系图；

图5是免疫组化实验检测znf146的结果图，显示了在鼻咽癌组织标本上的表达谱及与临床病理特征的相关性；其中，a-b显示免疫组化显示znf146表达在鼻咽癌中显著下调；

c是znf146在不同tnm分期鼻咽癌组织中表达的代表性图；

d显示znf146在不同tnm分期的阳性率；备注：*p<0.05,^#p<0.001；

图6是znf146沉默对鼻咽癌细胞的影响检测结果图，显示znf146沉默(采用shrna2)促进鼻咽癌细胞的体外增殖；其中，a-b显示znf146沉默促进鼻咽癌细胞(cne2和sune1细胞)体外增殖(cck8assay)；

c-d显示克隆形成实验证实沉默znf146促进鼻咽癌细胞(sune1和hone1-ebv细胞)体外增殖；备注：*p<0.05,^**p<0.01,^#p<0.001；

图7是znf146沉默对鼻咽癌细胞的干性影响检测结果图，显示znf146沉默(采用shrna2)增加鼻咽癌细胞的干性；其中，

a-b显示znf146沉默促进鼻咽癌细胞(cne2和sune1细胞)形成肿瘤球；

c显示znf146沉默促进鼻咽癌细胞(cne2和sune1细胞)中干性相关基因表达上调(westernblot检测结果)；

d-e显示znf146沉默促进鼻咽癌细胞(cne2和sune1细胞)中干性相关基因表达上调(qrt-pcr检测结果)；备注：*p<0.05,^**p<0.01,^#p<0.001；

图8是5-aca-dc处理npc细胞对znf146的影响检测结果图，显示5-aca-dc处理的npc细胞中znf146表达上调；采用去甲基化药物5-aca-dc(12μm/l)处理npc细胞72小时后，检测znf146mrna表达；nc为未加5-aca-dc处理的npc细胞；备注：^**p<0.01，^#p<0.001。

具体实施方式

本发明中涉及的部分实验的步骤和涉及的试剂介绍如下：

1、znf146免疫组化

烤片60分，脱蜡至水，柠檬酸盐修复3分，过氧化氢封闭10分，一抗(znf146抗体，购自sigma公司，货号：hpa003358)60分，二抗(酶标山羊抗兔igg聚合物，购自中杉金桥，货号：pv-6001)按试剂说明书，dab显色在光镜下控制时间。

2、rnai实验

znf146-shrna慢病毒质粒pilenti-shznf146-gfp-a(shznf146-a)、pilenti-shznf146-gfp-b(shznf146-b)、pilenti-shznf146-gfp-c(shznf146-c)和空载质粒pilenti-shscr-gfp(shscr)均购自上海权阳生物科技有限公司，慢病毒包装质粒pspax2和pmd2.g由瑞士日内瓦大学didiertrono博士惠赠。为了产生稳定的细胞系，如以下文献^[27]所述生产慢病毒(即lv-shscr，lv-shznf146-a，lv-shznf146-b和lv-znf146-c)，随后用于感染cne2、sune1和hone1-ebv细胞。沉默znf146的外源rna双链分子碱基序列如下(将序列中t替换为u即可)：

shrna1序列：

5'-gatccggccagaagaagtacctcataatgtgcttttatgaggtacttcttctggcttttttc-3'(seqidno.1)；

5'-aattgaaaaaagccagaagaagtacctcataaaagcacattatgaggtacttcttctggccg-3'(seqidno.2)；

shrna2序列：

5'-gatccgcctcactgagcatgagcattttgtgcttaaatgctcatgctcagtgaggttttttc-3'(seqidno.3)；

5'-aattgaaaaaacctcactgagcatgagcatttaagcacaaaatgctcatgctcagtgaggcg-3'(seqidno.4)；

shrna3序列：

5'-gatccgtcaacccttgctctgcatttgtgtgcttcaaatgcagagcaagggttgattttttc-3'(seqidno.5)；

5'-aattgaaaaaatcaacccttgctctgcatttgaagcacacaaatgcagagcaagggttgacg-3'(seqidno.6)。

其中，shrna1、shrna2、shrna3经实验证实都具有一定的沉默znf146的效果，以shrna2沉默znf146的效果为最佳。

3、平板克隆形成实验

1)取对数生长的细胞，将细胞消化，用pbs洗两次，计数。

2)将细胞稀释至10⁴/ml，6孔板(jet:tcp010006)里每孔加入2ml含10％fbs的1640培基(corning,10-040-cvr)，取100ul的细胞悬液加至6孔板，1000个细胞/孔。

3)将细胞铺匀，培养10-14天左右。

4)用pbs洗两遍，加甲醇固定15min，再用pbs洗两遍，加0.1％结晶紫染色15min，用清水洗去结晶紫，晾干。

5)拍照，计数。

4、肿瘤球形成实验

1)取对数生长的细胞，将细胞消化，用pbs洗两次，计数。

2)将细胞稀释至10⁴/ml，6孔板(jet:tcp001006)里每孔加入3ml含dmem.f12(corning:10-092-cvr)的肿瘤球3d培养基，取100ul的细胞悬液加至6孔板，1000个细胞/孔。

3)将细胞铺匀，培养7-10天左右。

4)镜下观察,不同倍数视野拍照，统计肿瘤球数量等。

5、cck8实验

1)取对数生长的细胞，将细胞消化，用pbs洗两次，计数；

2)在96孔板(jet:tcp010096)的边缘孔加入100ul的pbs；

3)将细胞稀释至10⁴/ml，加入100ul的细胞悬液加至里，1000个细胞/孔，5个复孔，每个细胞共铺25个孔；

4)铺板24小时后，避光将cck8试剂(thermo:ck04-500t)按1:100加入1640培基(含10％fbs)中，然后每孔加入100ul的cck8混合培基；

5)放入co2培养箱培养2小时；

6)酶标仪(biotek)，450nm检测；

7)第2-5天重复步骤4-6，收集整理数据。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中实验方法均为常规方法。

实施例1利用鼻咽癌临床标本基因芯片数据筛查到转录因子znf146

(1)本申请的发明人用基因芯片检测33例广东人鼻咽癌新鲜组织，同时从公共数据库geo下载两组(gse12452和gse13597；共69例)鼻咽癌基因芯片数据，累计收集102例标本数据，其中慢性鼻咽炎21例，鼻咽癌81例。经批次效应处理和数据整合后，发明人用这102例标本的基因芯片数据进行全基因组表达谱聚类分析发现，鼻咽癌可分成两个亚型(一型31例，二型50例)(图2)，需要说明的是，znf146并未在聚类图中出现，这是因为聚类之前，事先筛选表达波动比较大的基因，而znf146在102例样品中mrna表达波动很小；而且这两个亚型与tnm分期无关(表1)。

如图2所示，一型鼻咽癌31例，并与21例慢性鼻咽炎聚成一类；二型鼻咽癌50例。统计分析(卡方检验)显示，这两个亚型与tnm分期无关(表1)。如果把三组数据单独分析，结果也几乎完全一样(结果未显示)，说明该分型结果并非偶然发生的。

表1非角化性鼻咽癌分子亚型与tnm分期的相关性

(2)发明人用sam法(fdr＝0.001，上调基因均值>16)筛选两型的差异表达基因：一型非角化性鼻咽癌上调基因409个，二型非角化性鼻咽癌上调基因895个。基于交互信息理论^[5]，用这102例基因芯片数据构建890个转录因子^[28]对芯片上11182个基因的转录调控网络，识别转录因子znf146的关联基因富集最多的二型鼻咽癌标签基因(275个标签基因)。然后基于主要调节子分析(mra-fet)^[5]识别169个转录因子调控二型非角化性鼻咽癌895个上调基因。

其中五个转录因子znf146(275)、myc(263)、hmgxb4(213)、pms1(269)和foxm1(162)共调控635个(70.9％)二型上调基因(图3，4)。znf146调控了最多的275个上调基因，而且与另外三个主要调节因子myc、hmgxb4和pms1有调节关系(图3)。因此，推断znf146是二型非角化性鼻咽癌的核心调节因子之一。

实施例2

(1)znf146在鼻咽癌组织中表达下调

发明人采用免疫组化检测znf146在鼻咽癌和鼻咽非癌组织中的表达情况。结果显示，znf146在61例非癌组织中全部强阳性表达，而在177例鼻咽癌组织中仅有31例(17.5％)高表达(图5和表2)，说明znf146在鼻咽癌组织中表达下调；而且znf146表达与肿瘤t分期、颈部淋巴结转移、远处转移以及临床分期等有显著关联(图5和表3)。以上数据预示znf146可能与鼻咽癌发病相关。

表2znf146在61例鼻咽非癌组织标本和177例鼻咽癌组织标本中的表达谱

表3znf146表达与鼻咽癌临床病理特征的相关性

t:肿瘤大小；n:淋巴结转移；m:远处转移

(2)沉默znf146促进鼻咽癌细胞体外增殖和增加干性

通过rnai技术，其中采用shrna2(其碱基序列如seqidno.3和4所示)沉默znf146，建立了沉默znf146的鼻咽癌细胞株(hone1-ebv、cne2和sune1)。cck8实验和平板克隆形成实验揭示，rna干扰沉默znf146表达显著促进鼻咽癌细胞(cne2、hone1-ebv和sune1)增殖(图6)。znf146沉默后鼻咽癌细胞中干性基因表达显著上调，形成的肿瘤球数量多于对照，体积增大(图7)。

以上初步数据提示，沉默znf146促进鼻咽癌细胞体外增殖和增加干性。

实施例3启动子甲基化是znf146失活的原因之一

为探究启动子甲基化是否导致znf146在鼻咽癌中表达下调，发明人用去甲基化药物(5-杂氮-2-脱氧胞苷，5-aca-dc)处理鼻咽癌细胞(hone1-ebv、cne2、s18和sune1)；结果发现，四个细胞株处理后znf146mrna水平都显著升高(图8)。以上数据提示，启动子甲基化是znf146在鼻咽癌失活的原因之一。

实施例4e2f1是上游直接调控znf146的基因

目前上游直接调控znf146的基因尚未见报道，发明人首先预测结合到znf146启动子上的转录因子。采用三种不同的生物信息学方法：cisred^[29](http://www.cisred.org/)、genecards^[30](https://www.genecards.org/)和ernst方法^[31](http://sb.cs.cmu.edu/humantf/grid1000symbol.txt)。cisred根据znf146启动子序列与转录因子结合位点序列基序(motif)的匹配程度，预测29个转录因子与其结合。genecard基于ucsc基因组收集的161种转录因子的chip-seq数据，预测59个转录因子与znf146启动子结合。ernst方法整合29种基因组特征(如序列保守性、溶解温度和dnasei超敏区域等)，预测19个转录因子与znf146启动子结合。三种方法共同预测转录因子e2f1与znf146启动子结合(表4)。作为抑瘤基因的转录因子e2f1在调控细胞周期中发挥重要作用，其也是ebv转化蛋白的靶基因。

表4预测结合到znf146启动子上的转录因子

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29.robertsong,bilenkym,link,hea,yuenw,dagpinarm,varholr,teaguek,griffithol,zhangx,pany,hasselm,sleumermc,panw,pleasanceed,chuangm,haoh,liyy,robertsonn,fjellc,lib,montgomerysb,astakhovat,zhouj,sanderj,siddiquias,jonessj.cisred:adatabasesystemforgenome-scalecomputationaldiscoveryofregulatoryelements.nucleicacidsres,2006,34(databaseissue):d68-73.

30.stelzerg,rosenn,plaschkesi,zimmermans,twikm,fishilevichs,steinti,nudelr,liederi,mazory,kaplans,daharyd,warshawskyd,guan-golany,kohna,rappaportn,safranm,lancetd.thegenecardssuite:fromgenedataminingtodiseasegenomesequenceanalyses.currprotocbioinformatics,2016,54:1.30.1-1.30.33.

31.ernstj,plastererhl,simoni,bar-josephz.integratingmultipleevidencesourcestopredicttranscriptionfactorbindinginthehumangenome.genomeres.2010apr；20(4):526-36.

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

sequencelisting

<110>南方医科大学、广州序科码生物技术有限责任公司

<120>锌指蛋白znf146的用途

<130>2018

<160>6

<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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